致病疫霉NLP家族基因PiNLP30的克隆、原核表达及蛋白质纯化

河南农业科学 ›› 2014, Vol. 43 ›› Issue (10): 74-78.

致病疫霉NLP家族基因PiNLP30的克隆、原核表达及蛋白质纯化

朱丽丹，朱杰华，赵冬梅，杨志辉*，徐进

河北农业大学植物保护学院，河北保定 071000

收稿日期:2014-03-12 出版日期:2014-10-15 发布日期:2014-10-15
通讯作者: 杨志辉（1975-），男，河北藁城人，教授，博士，主要从事植物病理学方向的研究和教学工作。E-mail：bdyangzhihui@163.com
作者简介:朱丽丹（1989-），女，云南昆明人，在读硕士研究生，研究方向：植物病理学。E-mail：dandandang@sina.com
基金资助:

现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-10-P12）

Received:2014-03-12 Published:2014-10-15 Online:2014-10-15
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摘要/Abstract

摘要： 为了制备致病疫霉NLP家族中PiNLP30蛋白的多克隆抗体,根据GenBank中PiNLP30的cDNA序列及原核表达载体pET28b中的多克隆位点设计引物,对PiNLP30基因进行RT-PCR扩增和重组质粒pET28b-PiNLP30的构建,将重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)表达体系中进行诱导表达,通过SDS-PAGE检测蛋白质表达,并利用镍琼脂糖亲和层析进行蛋白质纯化。克隆和序列分析显示,该基因cDNA全长714bp,编码237个氨基酸。该基因编码蛋白质是一个主要由不规则卷曲组成的亲水蛋白,含有一段19个氨基酸的信号肽序列。预测蛋白质分子量为26.6kD,等电点5.49。经PCR、酶切及测序验证,成功构建了原核表达载体pET28b-PiNLP30,使用0.6mmol/L IPTG于37℃下诱导6h后蛋白质大量表达,表达的蛋白质主要以包涵体形式存在。经镍琼脂糖亲和层析进行纯化,获得了纯化的PiNLP30蛋白,其质量浓度约为0.3mg/mL。

关键词: 致病疫霉, PiNLP30基因, 序列分析, 原核表达, 蛋白质纯化

朱丽丹，朱杰华，赵冬梅，杨志辉，徐进. 致病疫霉NLP家族基因PiNLP30的克隆、原核表达及蛋白质纯化[J]. 河南农业科学, 2014, 43(10): 74-78.

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