河南农业科学 ›› 2021, Vol. 50 ›› Issue (4): 147-153.DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2021.04.019
所属专题: 基因编辑系统专题
王勋1,张雨杭1,孙亚宁2,3,李青梅3,李鸽1,王丽3,郭军庆3,邓瑞广3,张改平1,2,3
WANG Xun1,ZHANG Yuhang1,SUN Yaning2,3,LI Qingmei3,LI Ge1,WANG Li3,GUO Junqing3,DENG Ruiguang3,ZHANG Gaiping1,2,3
摘要: 为建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,在大肠杆菌中表达LwaCas13a重组蛋白,并对其连带剪切酶活性进行鉴定。将重组质粒pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a转化至Rosetta(DE3)感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性LwaCas13a重组蛋白。对诱导温度和时间进行优化,结果显示,在16 ℃条件下诱导培养15 h时,LwaCas13a重组蛋白的可溶性表达量最高。通过镍柱亲和层析法对表达的LwaCas13a重组蛋白进行纯化,得到单一的目的条带,纯化效果较为理想。此外,通过体外转录合成了1对CRISPR RNA及靶标RNA,建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,可在37 ℃条件下30 min内完成检测,对靶标RNA的检出限为31.2 nmol/L。综上,成功利用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株可溶性表达了LwaCas13a重组蛋白,且纯化后的LwaCas13a重组蛋白具有良好的连带剪切酶活性,建立了LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法。