基因编辑系统专题

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    1. 基于原生质体的谷子CRISPR/Cas9 基因编辑系统优化
    刘光宇, 徐晓静, 夏科科, 孙海汐, 陶月如, 崔震, 顾颖
    河南农业科学    2022, 51 (1): 34-42.   DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2022.01.005
    摘要394)      PDF (1847KB)(355)    收藏
    为了优化和筛选谷子中高效的CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISRP‐associated nuclease 9)基因编辑系统,针对谷子八氢番茄红素脱氢酶基因( SiPDS)设计6种gRNA(gRNA1—gRNA2针对外显子1,gRNA3—gRNA6针对外显子12),构建多种CRISPR/Cas9基因编辑系统,通过聚乙二醇(PEG)介导的方法转入谷子原生质体中,然后利用开发的大规模平行测序技术快速检测它们对SiPDS 的突变效率。结果表明,采用7 d谷子黄化苗幼茎建立的原生质体转化系统的转化效率较高,为50.44%~57.36%。将Super启动子(SP)、谷子内源的泛素启动子(Ubi)分别驱动Cas9 基因的基因编辑系统转入谷子原生质体中,发现两者对SiPDS 基因的突变效率分别为0.5%、5.5%。随后采用Ubi启动子驱动Cas9 基因,比较单一gRNA、双gRNA和tRNA结构的基因编辑系统对SiPDS 基因的突变效率,发现双gRNA 基因编辑系统Ubi-dgRNAE1和Ubi-dgRNAE12的突变效率分别较单一gRNA基因编辑系统提高了1.66倍和1.11倍;tRNA基因编辑系统Ubi-tRNA的突变效率较单一gRNA基因编辑系统提高了5.87倍,为51.24%,且Ubi-tRNA 可同时针对多个位点进行编辑,其多位点突变频率为3.23%。比较gRNA3、gRNA4、gRNA5体外转录产物分别与Cas9蛋白混合制成的核糖核蛋白(RNP)复合物的体外切割活性,发现RNP-gRNA5复合物体外切割活性最高,其对SiPDS 基因的突变效率是2.0%,并且引起的突变类型主要为小于3 bp的缺失。
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    2. CRISPR/Cas9 技术在作物遗传育种中的应用进展
    焦耀磊, 王春生, 曲硕, 孙珊珊, 朱婷婷, 赵贺, 王丕武
    河南农业科学    2021, 50 (7): 1-7.   DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2021.07.001
    摘要727)      PDF (6994KB)(594)    收藏
    CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISRP‑associated nuclease 9)是继ZFNs(Zinc finger nucleases)和TALENs(Transcription activator like effector nucleases)之后出现的新型基因组定点编辑技术,相较于前两代技术,具有简便、高效等特点。CRISPR/Cas9不仅是一种基础性研究工具,而且已经成为目前有用的分子育种工具之一,在作物遗传改良方面取得重要应用进展。综述了CRISPR/Cas9系统的结构、分类、作用机制及在作物品质改良、产量提升、抗性育种和雄性不育材料选育中的应用进展,并探讨了其存在的问题,展望了其应用前景。
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    3. 基于CRISPR-Cas9的拟南芥基因编辑后代鉴定技术的优化
    李子文, 刘言, 吕梦洋, 高凯莉, 张海荣
    河南农业科学    2021, 50 (4): 17-21.   DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2021.04.003
    摘要323)      PDF (3339KB)(344)    收藏
    利用CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated nuclease 9)系统对植物进行定点编辑的技术已经日渐成熟,但对于被编辑植株后代的鉴定依旧费时费力,以拟南芥 SDP1(Sugar-dependent 1)基因为编辑对象,优化编辑植株后代的鉴定方法。对 SDP1基因序列进行分析表明, SDP1基因外显子上含有PAM(Protospacer adjacent motif)序列,且其上游合适的酶切位点有4个,选择第二外显子上含有最常见的SacⅠ酶切位点的20 bp序列作为基因敲除的靶位点,构建了CRISPR- SDP1-Cas9载体,实现对 SDP1基因的定点编辑。对经过潮霉素筛选的T 1株系DNA进行酶切鉴定和测序峰图分析,选出SacⅠ酶切为3条带的杂合编辑植株,随机挑选的71株T 1植株中有24株发生了杂合编辑,编辑效率为16.9%。在48株T 2转基因植株中有5株发生了纯合编辑,经测序编辑位点均为SacⅠ酶切位点上碱基插入。综上,选用待编辑基因上PAM序列附近合适的酶切位点作为编辑靶点,通过酶切和测序峰图分析来鉴定后代植株,相比于传统方法对后代植株提取DNA、PCR扩增靶位点、连接T载体后进行多次测序,此方法方便、快捷且经济实用,为CRISPR-Cas9基因编辑后代鉴定提供了简单、快捷的方法。
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    4. CRISPR/Cas13a重组蛋白表达纯化及其连带剪切酶活性的鉴定
    王勋, 张雨杭, 孙亚宁, 李青梅, 李鸽, 王丽, 郭军庆, 邓瑞广, 张改平
    河南农业科学    2021, 50 (4): 147-153.   DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2021.04.019
    摘要366)      PDF (4597KB)(647)    收藏
    为建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,在大肠杆菌中表达LwaCas13a重组蛋白,并对其连带剪切酶活性进行鉴定。将重组质粒pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a转化至Rosetta(DE3)感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性LwaCas13a重组蛋白。对诱导温度和时间进行优化,结果显示,在16 ℃条件下诱导培养15 h时,LwaCas13a重组蛋白的可溶性表达量最高。通过镍柱亲和层析法对表达的LwaCas13a重组蛋白进行纯化,得到单一的目的条带,纯化效果较为理想。此外,通过体外转录合成了1对CRISPR RNA及靶标RNA,建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,可在37 ℃条件下30 min内完成检测,对靶标RNA的检出限为31.2 nmol/L。综上,成功利用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株可溶性表达了LwaCas13a重组蛋白,且纯化后的LwaCas13a重组蛋白具有良好的连带剪切酶活性,建立了LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法。
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    5. 利用 CRISPR-Cas9基因编辑技术制备牛MSTN基因编辑胚胎
    尉翔栋,吕晨晨,朱肖亭,冯亚杰,辛晓玲,施巧婷,梁瑞清,徐照学,王二耀,滑留帅
    河南农业科学    2019, 48 (2): 131-136.  
    摘要128)      PDF (1321KB)(342)    收藏
    为了给双肌肉牛品种的培育提供新的遗传素材,拟利用 CRISPR-Cas9基因编辑技术制备牛MSTN基因编辑胚胎。从采集到的86对牛卵巢中收集卵母细胞进行成熟培养以及体外受精,并使用在线软件设计能够在体外高效编辑牛MSTN基因的gRNA序列,将验证后所得的体外切割活性最高的gRNA与Cas9 mRNA的混合物显微注射牛的受精卵,培养至囊胚后,利用T7EI核酸内切酶法检测囊胚中MSTN基因的编辑情况,然后将基因编辑阳性的囊胚样品进行测序验证。结果表明,牛胚胎体外培养平均囊胚率为21.28%;在设计的多条gRNA序列中,gRNA5的体外切割活性最高,为96.00%;将Cas9 mRNA和gRNA5的混合物显微注射受精卵并培养至囊胚后,T7EI核酸内切酶检测表明囊胚MSTN基因切割阳性率为15.40%;对MSTN基因编辑囊胚阳性样品测序表明,在gRNA5靶位点存在部分片段缺失。综上,说明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功获得了牛MSTN基因编辑胚胎。
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