禽腺病毒血清4 型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 检测方法的建立与应用

doi:10.15933/j.cnki.1004-3268.2022.12.015

河南农业科学 ›› 2022, Vol. 51 ›› Issue (12): 131-138.DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2022.12.015

禽腺病毒血清4 型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 检测方法的建立与应用

卢清侠^1,2,3，金前跃^1,2,3，冯丽丽⁴，柴永笑^1,2,3,5，郭振华^1,2,3，邢广旭^1,2,3，张改平^1,2,3

（1.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州 450002；2.河南省农业科学院中英禽病国际研究中心，河南郑州 450002；3.江苏高校动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009；4.河南省农业科学院农业经济与信息研究所，河南郑州 450002；5.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100）

收稿日期:2022-05-30 出版日期:2022-12-15 发布日期:2023-01-17
通讯作者: 张改平（1960-），男，河南内黄人，研究员，中国工程院院士，博士，主要从事动物免疫学研究。E-mail：zhanggaiping2003@163.com
作者简介:卢清侠（1982-），女，山西侯马人，副研究员，博士，主要从事动物病毒学与免疫学研究。E-mail：luqingxia82@163.com
基金资助:
河南省农业科学院自主创新项目（2022ZC67）；中原英才计划”（育才系列）-中原青年拔尖人才项目（ZYYCYU202012148）；河南省自然科学基金优秀青年科学基金项目（222300420051）

Development and Application of SYBR Green Ⅰ‑Based Real‑time PCR Assay Method for Detection of Fowl Adenovirus Serotype 4

LU Qingxia^1,2,3，JIN Qianyue^1,2,3，FENG Lili⁴，CHAI Yongxiao^1,2,3,5，GUO Zhenhua^1,2,3，XING Guangxu^1,2,3，ZHANG Gaiping^1,2,3

（1.Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；2.UK‑China Centre of Excellence for Research on Avian Diseases，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；3.Jiangsu Co‑innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China；4.Institute of Agricultural Economy and Information，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；5. College of Veterinary Medicine，Northwest A & F University，Yangling 712100，China）

Received:2022-05-30 Published:2022-12-15 Online:2023-01-17

摘要/Abstract

摘要： 为建立禽腺病毒血清4 型（Fowl adenovirus serotype 4，FAdV4）临床检测方法，根据GenBank 中该病毒Hexon 基因序列设计扩增引物，将扩增的Hexon 基因连接至pEASY-Blunt 载体，构建重组质粒pEASY-Blunt-Hexon，同时对Hexon 基因进行分析，选取高度保守区域，设计荧光定量检测引物，建立FAdV4 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。该方法扩增产物长度为95 bp，最低检测下限为7.1×10²拷贝/μL，且与其他禽源病毒无交叉反应，批内和批间重复性试验变异系数均不超过2%，具有良好的特异性和重复性。将建立的检测方法应用于检测FAdV4在鸡肝癌细胞（Leghorn male hepatocellular cells，LMH）上的增殖特性，并与TCID₅₀法测定的病毒滴度进行比较，结果显示，2种检测方法具有良好的相关性。综上，本研究建立的检测方法可用于FAdV4的临床早期快速检测。

关键词: 禽腺病毒血清4型, Hexon基因, 荧光定量PCR, 检测

Abstract: To develop an assay method for the clinical detection of fowl adenovirus serotype 4（FAdV4），a pair of primers was designed according to the Hexon gene sequence of FAdV4 in GenBank.The amplified Hexon gene was ligated with the vector pEASY‑Blunt to construct recombinant plasmid pEASY‑Blunt‑Hexon，which then served as the template.Real‑time PCR assay method for the detection of FAdV4 was established using primers amplifying the conserved region of Hexon gene.The amplified product was 95 bp in length and the limit of detection reached 7.1×10² copies/μL.The assay had no cross‑reaction with other poultry viruses.The coefficient of variation was less than 2% within and between the groups，which showed good specificity and repeatability.The detection result of the proliferation of FAdV4 on leghorn male hepatocellular（LMH）cells exhibited good associations with the viral titers by measuring TCID₅₀.In conclusion，the real‑time PCR assay method developed in this study is applicable for the early detection of FAdV4 clinically.

Key words: FAdV4, Hexon gene, Real?time PCR, Detection

中图分类号:

S852.65

卢清侠, 金前跃, 冯丽丽, 柴永笑, 郭振华, 邢广旭, 张改平. 禽腺病毒血清4 型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 检测方法的建立与应用[J]. 河南农业科学, 2022, 51(12): 131-138.

LU Qingxia, JIN Qianyue, FENG Lili, CHAI Yongxiao, GUO Zhenhua, XING Guangxu, ZHANG Gaiping. Development and Application of SYBR Green Ⅰ‑Based Real‑time PCR Assay Method for Detection of Fowl Adenovirus Serotype 4[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2022, 51(12): 131-138.

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禽腺病毒血清4 型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 检测方法的建立与应用

Development and Application of SYBR Green Ⅰ‑Based Real‑time PCR Assay Method for Detection of Fowl Adenovirus Serotype 4

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