嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA1182 的原核表达、纯化与免疫原性研究

doi:10.15933/j.cnki.1004-3268.2022.11.016

河南农业科学 ›› 2022, Vol. 51 ›› Issue (11): 135-144.DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2022.11.016

所属专题：动物新型疫苗专题

嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA1182 的原核表达、纯化与免疫原性研究

简思杰^1,2，晁嘉^1,2，孙薇^1,3，陈锐^1,4，丁锐^1,4，陈琛^1,3,5，刘祥^1,2

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院/中德天然产物研究所，陕西汉中 723001；2.阜阳师范大学生物与食品工程学院，安徽阜阳 236037；3.陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心，陕西汉中 723001；4.陕西理工大学秦巴生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室（培育），陕西汉中 723001；5.陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中 723001）

收稿日期:2022-06-09 出版日期:2022-11-15 发布日期:2023-01-10
通讯作者: 陈琛（1978-），男，陕西宝鸡人，教授，博士，主要从事蛋白质与多肽生物化学研究。E-mail：cchen@snut.edu.cn 刘祥（1983-），男，安徽合肥人，副教授，博士，主要从事动物疫苗开发研究。E-mail：liuxiang888525@163.com
作者简介:简思杰（1997-），男，陕西渭南人，在读硕士研究生，研究方向：动物疫苗开发。E-mail：814964418@qq.com
基金资助:
陕西省科技厅面上项目（2022JM-120）；国家外国专家局项目（GDT20186100426）

Prokaryotic Expression，Purification and Immunogenicity Study of Outer Membrane Protein AHA1182 of Aeromonas hydrophila

JIAN Sijie^1,2，CHAO Jia^1,2，SUN Wei^1,3，CHEN Rui^1,4，DING Rui^1,4，CHEN Chen^1,3,5，LIU Xiang^1,2

（1.Chinese‑German Joint Institute for Naturel Product Research/College of Biological Sciences and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，China；2.School of Biology and Food Engineering，Fuyang Normal University，Fuyang 236037，China；3.Qinling‑Bashan Mountains Bioresources Comprehensive Development C.I.C.，Hanzhong 723001，China；4.Qinba State Key Laboratory of Biological，Hanzhong 723001，China；5.Shaanxi Province Key Laboratory of Bio‑resources，Hanzhong 723001，China）

Received:2022-06-09 Published:2022-11-15 Online:2023-01-10

摘要/Abstract

摘要： 为探究嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA1182的免疫原性，依据AHA1182氨基酸序列，采用生物信息学分析嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、简氏气单胞菌、多样气单胞菌、舒氏气单胞菌、产碱普罗维登斯菌以及爱德华氏菌之间的亲缘关系；构建AHA1182原核表达菌株并确定最佳诱导表达条件；采用包涵体洗涤及SDS-PAGE 切胶纯化方法获得AHA1182 蛋白并免疫红鲫；利用Western blot 检测红鲫抗AHA1182蛋白血清的特异性与效价；采用酶联免疫吸附（ELISA）法模拟红鲫抗AHA1182蛋白抗体血清与嗜水气单胞菌的体外相互识别作用；通过测定酸性、碱性磷酸酶（ACP、AKP）活性与细胞吞噬作用，评价非特异性免疫；利用组织病理学切片探究AHA1182 蛋白免疫对红鲫内脏的影响。结果显示，AHA1182蛋白家族在不同菌株间均具有亲缘性，尤其在气单胞菌间亲缘关系较近，由此推测，AHA1182蛋白抗血清具有交叉免疫保护作用；成功克隆、表达、纯化AHA1182，最佳诱导条件：菌液浓度OD₆₀₀=1.0，IPTG终浓度为0.5 mmol/L，在28℃条件下诱导8 h；红鲫AHA1182蛋白抗血清具有良好的特异性，AHA1182蛋白抗体与嗜水气单胞菌特异性结合（滴度可达1∶3 200）；AKP、ACP、细胞吞噬作用均显示，AHA1182蛋白可激活红鲫非特异性免疫。从组织病理学切片可以看出，AHA1182蛋白对红鲫内脏结构无影响。综上，嗜水气单胞菌AHA1182蛋白具有良好的免疫原性。

关键词: 嗜水气单胞菌, 外膜蛋白AHA1182, 原核表达, 免疫原性, 红鲫血浆, 组织病理学切片, 主动免疫

Abstract: To evaluate the immunogenicity of outer membrane protein AHA1182 of Aeromonas hydrophila，bioinformatics method was firstly performed to analyze the relationship among A.hydrophila，A.salmonicida，A.schubertii，A.diversa，A.jandaei，Providenci alcalifaciens and Edwardsiella ictaluri.Recombinant expression strain of AHA1182 was constructed by molecular cloning and the optimal expression conditions were identified. AHA1182 was purified by inclusion body washing and SDS‑PAGE，and was used to immunize Carassius auratus.Western blot was used to assess the specificity and titer of the C.auratus serum，and enzyme‑linked immunosorbent assay（ELISA） was used to simulate the recognition effect between anti‑AHA1182 serum and A.hydrophila. Nonspecific immunity was assessed by acid phosphatase（ACP），alkaline phosphatase（AKP）and leukocyte phagocytosis.Furthermore，the toxicity of AHA1182 immunization to C.auratus was investigated by histopathological sections of visceral organ.The results showed that AHA1182 was genetically related among different bacteria，especially in Aeromonas，which meant that AHA1182 serum might have cross‑immune protective ability.AHA1182 was cloned，expressed and purified successfully，and the optimal expression conditions for AHA1182 included strain OD₆₀₀ value of 1.0，isopropyl‑β‑D‑thiogalactoside（IPTG）concentration of 0.5 mmol/L，inducing temperature of 28 ℃ and inducing time of 8 hours.Western blot showed that AHA1182 serum had a high specificity and could recognize A.hydrophila in vitro with the titer of 1∶3 200.The results of AKP，ACP，and leukocyte phagocytosis indicated that AHA1182 stimulated the non‑specific immune of C.auratus. AHA1182 immunization had no toxicity to the visceral structure of C.auratus.The results suggest that A.hydrophila AHA1182 has good immunogenicity.

Key words: Aeromonas hydrophila, Outer membrane protein AHA1182, Prokaryotic expression, Immunogenicity, C.auratus plasma, Histopathological section, Active immunity

中图分类号:

S852.4
Q71

简思杰, 晁嘉, 孙薇, 陈锐, 丁锐, 陈琛, 刘祥. 嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA1182 的原核表达、纯化与免疫原性研究[J]. 河南农业科学, 2022, 51(11): 135-144.

JIAN Sijie, CHAO Jia, SUN Wei, CHEN Rui, DING Rui, CHEN Chen, LIU Xiang. Prokaryotic Expression，Purification and Immunogenicity Study of Outer Membrane Protein AHA1182 of Aeromonas hydrophila[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2022, 51(11): 135-144.

参考文献

［1］潘吉脉，吴良涛，杨霞，等.温度、pH、盐度和碳氮源对嗜水气单胞菌GZ1株生长的影响［J］.水产学杂志，2019，32（4）：63‑67.
PAN J M，WU L T，YANG X，et al.Effects of temperature，pH value，salinity and carbon and nitrogen sources on growth of Aeromonas hydrophila strain GZ1［J］.Chinese Journal of Fisheries，2019，32（4）：63‑67.
［2］钱冬，陈月英，沈锦玉，沈智华.引起鱼类暴发性流行病的嗜水气单胞菌的血清型、毒力及溶血性［J］.微生物学报，1995，35（6）：460‑464.
QIAN D，CHEN Y Y，SHEN J Y，et al.Serogroups，virulence and hemolytic activity of Aeromonas hydrophila which caused fish bacterial septicaemia［J］.Acta Microbiologica Sinica，1995，35（6）：460‑464.
［3］农业农村部渔业渔政管理局，全国水产技术推广总站，中国水产学会.2021中国渔业统计年鉴［M］.北京：中国农业出版社，2021.
Fisheries and Fisheries Administration，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，National Aquatic Technology Promotion Station，China Fisheries Society.China fishery statistical yearbook 2021［M］.Beijing：China Agricultural Press，2021.
［4］陆承平.兽医微生物学［M］.5版. 北京：中国农业出版社，2013：123‑127.
LU C P.Veterinary microbiology［M］.5th ed. Beijing：China Agricultural Press，2013：123‑127.
［5］蔡丽娟，许宝青，林启存.水产致病性嗜水气单胞菌耐药性比较与分析［J］.水产科学，2011，30（1）：42‑45.
CAI L J，XU B Q，LIN Q C.Comparison and analysis of drug resistance to morbific bacterium Aeromonas hydrophila isolated from aquatic animals［J］.Fisheries Science，2011，30（1）：42‑45.
［6］武瑶，李小艳，林潇可，等.鱼类革兰氏阴性病原菌外膜蛋白疫苗的研究进展［J］.生命科学，2021，33（3）：383‑391.
WU Y，LI X Y R，LIN X K et al.Research progress of outer membrane protein vaccine of fish gram‑negative pathogenic bacteria［J］.Chinese Bulletin of Life Sciences，2021，33（3）：383‑391.
［7］TANG X，WANG H，LIU F，et al.Recombinant outer membrane protein T（OmpT）of Vibrio ichthyoenteri，a potential vaccine candidate for flounder（Paralichthys olivaceus）［J］.Microbial Pathogenesis，2019，126：185‑192.
［8］SUN W，RONG N，JIAN S J，et al.Immune responses and protective efficacy of outer membrane protein ExbB of Pseudomonas fluorescens against Aeromonas hydrophila and Pseudomonas fluorescens affecting Carassius auratus［J］.Aquaculture International，2021，29（6）：2823‑2840.
［9］LIU X，SUN W，JIAN S J，et al.Passive protective ability of the outer membrane protein PF1380 of Pseudomonas fluorescens against the major pathogenic bacteria of freshwater aquaculture in fish［J］.Aquaculture Reports，2022，22：1‑8.
［10］毛然然，李小艳，武瑶，等.嗜水气单胞菌OprM蛋白的克隆表达与免疫保护作用评价［J］.生物技术通报，2019，35（9）：244‑248.
MAO R R，LI X Y，WU Y，et al.Cloning and expression of outer membrane protein OprM from Aeromonas hydrophila and the evaluation of its immunoprotective effect［J］.Biotechnology Bulletin，2019，35（9）：244‑248.
［11］荣娜，简思杰，孙薇，等.鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的原核表达、免疫保护及抗血浆杀菌作用研究［J］.西北农业学报，2021，30（3）：333‑342.
RONG N，JIAN S J，SUN W，et al.Study on the Prokaryotic Expression，immunoprotective effect and resistance to plasma sterilization of the outer membrane protein P5 of fish pathogenic Aeromonas hydrophila［J］.Acta Agriculturae Boreali‑occidentalis Sinica，2021，30（3）：333‑342.
［12］荣娜，简思杰，孙薇，等.鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白TolC的原核表达及抗原性分析［J］.河南农业科学，2021，50（3）：157‑164.
RONG N，JIAN S J，SUN W，et al.Prokaryotic expression and antigenicity analysis of outer membrane protein TolC of fish pathogenic Aeromonas hydrophila［J］.Journal of Henan Agricultural Sciences，2021，50（3）：157‑164.
［13］LIU X，SHE X T，ZHU Q F，et al.Heterogeneous interactome between Litopenaeus vannamei plasma proteins and Vibrio parahaemolyticus outer membrane proteins［J］.Fish & Shellfish Immunology，2013，34（1）：192‑198.
［14］李雷，严建燕，苏欣，等.大鼠睾丸组织固定法的优选研究［J］.中国比较医学杂志，2013，23（6）：80‑82.
LI L，YAN J Y，SU X，et al.Selection of optimal fixative for preservation of rat testis［J］.Chinese Journal of Comparative Medicine，2013，23（6）：80‑82.
［15］唐英，夏虎，陆风辉，等.鱼类感染嗜水气单胞菌后的病理特征及其防控措施［J］.湖南文理学院学报（自然科学版），2017，29（3）：33‑38.
TANG Y，XIA H，LU F H，et al.The effect of Aeromonas hydrophila on fish pathogenicity and prevention and control measures［J］.Journal of Hunan University of Arts and Science（Science and Technology），2017，29（3）：33‑38.
［16］伍娜娜，康超，荣娜，等.溶藻弧菌TolB蛋白的生物信息学分析［J］.河南农业科学，2018，47（11）：134‑141.
WU N N，KANG C，RONG N，et al.Bioinformatics analysis of Vibrio alginolyticus TolB protein［J］.Journal of Henan Agricultural Sciences，2018，47（11）：134‑141.
［17］伍娜娜，康超，荣娜，等.大肠杆菌外膜蛋白F的原核表达、多克隆抗体制备及生物信息学分析［J］.河南农业科学，2019，48（3）：145‑152.
WU N N，KANG C，RONG N，et al.Prokaryotic expression，polyclonal antibody preparation and bioinformatics analysis of Escherichia coli outer membrane protein F［J］.Journal of Henan Agricultural Sciences，2019，48（3）：145‑152.
［18］荣娜，康超，孙薇，等.嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpK的原核表达、抗原性分析及抗血浆杀菌作用研究［J］.西南农业学报，2021，34（6）：1359‑1366.
RONG N，KANG C，SUN W，et al.Study on prokaryotic expression，antigenicity and resistance to plasma sterilization of outer membrane protein OmpK of Aeromonas hydrophila［J］.Southwest China Journal of Agricultural Sciences，2021，34（6）：1359‑1366.
［19］刘玮，倪穗，邱军强，等.嗜水气单胞菌BYKAH2008AC株外膜蛋白和溶血素双基因的融合表达及免疫原性分析［J］.生物学杂志，2012，29（4）：17‑21.
LIU W，NI H，QIU J Q，et al.Fusion expression and immunogenicity analysis of OmpTS gene with Hly gene of Aeromonas hydrophila strain BYKAH2008AC［J］.Journal of Biology，2012，29（4）：17‑21.
［20］刘望，杨佳杰，杨静，等.嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究［J］.陕西科技大学学报，2017，35（6）：125‑130.
LIU W，YANG J J，YANG J，et al.The prokaryotic expression and immunoprotecition analysis of outer membrane proteins of Aeromonas hydrophila［J］.Journal of Shaanxi University of Science and Technology，2017，35（6）：125‑130.
［21］KHUSHIRAMANI R M，MAITI B，SHEKAR M，et al.Recombinant Aeromonas hydrophila outer membrane protein 48（Omp48） induces a protective immune response against Aeromonas hydrophila and Edwardsiella tarda［J］.Research in Microbiology，2012，163（4）：286‑291.
［22］LIU X，YANG M J，WANG S N，et al.Differential antibody responses to outer membrane proteins contribute to differential immune protections between live and inactivated Vibrio parahemolyticus［J］.J Proteome Res，2018，17（9）：2987‑2994.
［23］毕建飞，张海朋，曲磊，等.维氏气单胞菌3种免疫原对鲫鱼ACP、AKP、POD和SOD活力的影响［J］.黑龙江畜牧兽医，2017（9）：12‑15.
BI J F，ZHANG H P，QU L，et al.The effects of three types of Aeromonas veronii immunogen on activities of ACP，AKP，POD and SOD in blood of Carassius［J］.Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2017，2017（9）：12‑15.
［24］赵娜，唐小千，绳秀珍，等.海豚链球菌3种免疫原对牙鲆血细胞吞噬及SOD、POD和ACP活力的影响［J］.中国海洋大学学报（自然科学版），2012，42（4）：33‑40.
ZHAO N，TANG X Q，SHENG X Z，et al.Effects of three types of Streptococcus iniae immunogen on phagocytes，SOD，POD and ACP in the blood of japanese flounder，Paralichthys olivaceus［J］.Periodical of Ocean University of China（Science Edition），2012，42（4）：33‑40.
［25］张海彬，李慧.乌鳢出血性败血症病理组织学初步研究［J］.水利渔业，2007，27（3）：108‑112.
ZHANG H B，LI H.Preliminary study on histopathology of hemorrhagic sepsis in Channa argus［J］.Journal of Hydroecology，2007，27（3）：108‑112.
［26］兰蕾，常小荣，张国山，等.艾烟对大鼠病理组织切片和肺HSP70及Caspase-9表达的影响［J］.中华中医药杂志，2012，27（4）：1042‑1047.
LAN L，CHANG X Y，ZHANG G S，et al.Influence of moxa smoke on pathologic biopsy of rats and expression of lung HSP70，Caspase‑9［J］.China Journal of Traditional Chinese Medicine， 2012， 27 （4）：1042‑1047.

[1]	陈甜梦, 蔡彤璇, 王嘉璐, 田牧野, 赵宝华, 刘东. 嗜水气单胞菌外膜蛋白TolB 的原核表达及生物信息学分析[J]. 河南农业科学, 2024, 53(2): 136-143.
[2]	徐佳, 孙怀昌. 牛支原体Vsp 蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备[J]. 河南农业科学, 2023, 52(12): 142-148.
[3]	路庆君, 罗竹星, 刘华伟, 魏梦, 王圆, 张照锋, 李游山. 家蚕丝腺中Abd-A 3 种剪接体的克隆、序列分析及原核表达[J]. 河南农业科学, 2022, 51(4): 138-150.
[4]	陈维聪, 刘运超, 周川杰, 杨苏珍, 魏蔷, 柴书军, 张改平. 猪流行性腹泻病毒S1 蛋白的免疫原性评估[J]. 河南农业科学, 2022, 51(11): 127-134.
[5]	耿笑林, 孙杰, 王彦伟, 黄甜, 刘鹏, 曹红梅, 逄文强, 郝丽影, 邓均华, 黄玉欣, 田克恭. 非洲猪瘟病毒K145R 蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备[J]. 河南农业科学, 2021, 50(8): 154-159.
[6]	任春晓, 冯华, 张腾, 蒋敏, 刘运超, 金前跃, 张改平. 中和表位串联的PCV2b 病毒样颗粒在昆虫细胞中的表达与鉴定[J]. 河南农业科学, 2021, 50(7): 154-160.
[7]	徐引弟, 焦文强, 王治方, 李海利, 张青娴, 朱文豪, 王克领. 鸡滑液囊支原体河南株的分离鉴定与生物学特性研究[J]. 河南农业科学, 2021, 50(7): 168-173.
[8]	王勋, 张雨杭, 孙亚宁, 李青梅, 李鸽, 王丽, 郭军庆, 邓瑞广, 张改平. CRISPR/Cas13a重组蛋白表达纯化及其连带剪切酶活性的鉴定[J]. 河南农业科学, 2021, 50(4): 147-153.
[9]	荣娜, 简思杰, 孙薇, 康超, 陈琛, 刘祥. 鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白TolC的原核表达及抗原性分析[J]. 河南农业科学, 2021, 50(3): 157-164.
[10]	谭政委, 李磊, 余永亮, 许兰杰, 杨红旗, 董薇, 鲁丹丹, 马新明, 梁慧珍. 红花1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因CtDXS1的克隆及表达分析 [J]. 河南农业科学, 2021, 50(2): 39-49.
[11]	李甜甜, 蒋大伟, 姬鹏超, 王银铃, 张改平. 传染性法氏囊病毒VP2蛋白的原核表达及其免疫效果评价[J]. 河南农业科学, 2020, 49(9): 136-142.
[12]	徐引弟, 张青娴, 王治方, 焦文强, 李海利, 朱文豪, 王克领. 猪肺炎支原体HNMhy1株免疫原性基因的鉴定与分析[J]. 河南农业科学, 2020, 49(9): 153-158.
[13]	刘艳阳, 武轲, 梅鸿献, 杜振伟, 崔承齐, 江晓林, 郑永战. 芝麻抗裂蒴基因SiIND1的克隆与原核表达[J]. 河南农业科学, 2020, 49(5): 63-68.
[14]	王雨, 王兆广, 刘泽军, 夏中曦, 范玉顶, 钟其旺. 黄鳝atrogin-1蛋白表达及细胞定位研究[J]. 河南农业科学, 2020, 49(5): 154-160.
[15]	滕蔓, 迟佳琦, 柴书军, 罗俊. 鸡LTBP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 河南农业科学, 2020, 49(12): 144-150.

嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA1182 的原核表达、纯化与免疫原性研究

Prokaryotic Expression，Purification and Immunogenicity Study of Outer Membrane Protein AHA1182 of Aeromonas hydrophila

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