动物新型疫苗专题

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1. 猪流行性腹泻病毒S1 蛋白的免疫原性评估

陈维聪, 刘运超, 周川杰, 杨苏珍, 魏蔷, 柴书军, 张改平

河南农业科学 2022, 51 (11): 127-134. DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2022.11.015

摘要（111）

PDF （6470KB）（93）

为了评估猪流行性腹泻病毒（PEDV）S1蛋白的免疫原性，利用果蝇胚胎S2细胞表达重组S1蛋白，将纯化的S1蛋白免疫4周龄昆明小鼠，收集免疫血清及脾淋巴细胞，通过ELISA、病毒中和试验和流式细胞术等方法分析表达的重组S1蛋白的免疫原性。结果显示，与对照组（PBS）相比，重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠血清中特异性IgG抗体水平显著提升；二免后14 d，果蝇细胞重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠的中和抗体效价达到1∶320；免疫后小鼠脾脏淋巴细胞具有更强的增殖能力；外周血CD3 ⁺T细胞百分比显著增加，CD4 ⁺/CD8 ⁺T细胞比值高于对照组；小鼠血清中IL-4、IFN-γ水平显著上升。综上，成功表达了重组PEDV S1蛋白，其可以诱导小鼠产生高效价的中和抗体，促进细胞免疫应答。

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2. 嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA1182 的原核表达、纯化与免疫原性研究

简思杰, 晁嘉, 孙薇, 陈锐, 丁锐, 陈琛, 刘祥

河南农业科学 2022, 51 (11): 135-144. DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2022.11.016

摘要（102）

PDF （9000KB）（36）

为探究嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA1182的免疫原性，依据AHA1182氨基酸序列，采用生物信息学分析嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、简氏气单胞菌、多样气单胞菌、舒氏气单胞菌、产碱普罗维登斯菌以及爱德华氏菌之间的亲缘关系；构建AHA1182原核表达菌株并确定最佳诱导表达条件；采用包涵体洗涤及SDS-PAGE 切胶纯化方法获得AHA1182 蛋白并免疫红鲫；利用Western blot 检测红鲫抗AHA1182蛋白血清的特异性与效价；采用酶联免疫吸附（ELISA）法模拟红鲫抗AHA1182蛋白抗体血清与嗜水气单胞菌的体外相互识别作用；通过测定酸性、碱性磷酸酶（ACP、AKP）活性与细胞吞噬作用，评价非特异性免疫；利用组织病理学切片探究AHA1182 蛋白免疫对红鲫内脏的影响。结果显示，AHA1182蛋白家族在不同菌株间均具有亲缘性，尤其在气单胞菌间亲缘关系较近，由此推测，AHA1182蛋白抗血清具有交叉免疫保护作用；成功克隆、表达、纯化AHA1182，最佳诱导条件：菌液浓度OD ₆₀₀=1.0，IPTG终浓度为0.5 mmol/L，在28℃条件下诱导8 h；红鲫AHA1182蛋白抗血清具有良好的特异性，AHA1182蛋白抗体与嗜水气单胞菌特异性结合（滴度可达1∶3 200）；AKP、ACP、细胞吞噬作用均显示，AHA1182蛋白可激活红鲫非特异性免疫。从组织病理学切片可以看出，AHA1182蛋白对红鲫内脏结构无影响。综上，嗜水气单胞菌AHA1182蛋白具有良好的免疫原性。

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3. 2020—2021 年市售马立克病疫苗的效价测定及质量评估

郑鹿平, 滕蔓, 刘金玲, 罗琴, 楚钰淑, 王伟东, 张文凯, 罗俊

河南农业科学 2022, 51 (6): 134-143. DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2022.06.015

摘要（294）

PDF （3380KB）（101）

为了解和评估现有鸡马立克病（MD）疫苗的质量，采用间接免疫荧光试验（IFA）对2020—2021年市场销售的9家不同企业生产的11个批次MD疫苗产品进行病毒效价测定和对比分析，同时用ELISA试剂盒、胶体金试纸条或RT-PCR 方法分别对禽白血病病毒（ALV）和禽网状内皮组织增生症病毒（REV）的污染状况进行检测。结果表明，在所检测的MD液氮苗中，3批进口或国产的CVI988单价液氮苗之间病毒效价无显著差异，2批不同品牌814单价液氮苗效价差异显著( P<0.05)，2批不同品牌双价液氮苗（CVI988+HVT或814+HVT）病毒效价差异极显著( P<0.01)，但上述全部类型液氮苗产品的病毒效价均大于5 500 PFU/羽份，达到国标规定值2倍以上。然而，4批不同品牌HVT冻干苗的病毒效价均远低于产品说明书标注的2 000 PFU/羽份，仅为83.90~109.50 PFU/羽份。全部MD 疫苗产品的ALV和REV检测结果均为阴性，表明这些产品洁净无污染。

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4. 鸡白痢沙门菌ssaV 基因缺失株的构建及其生物学特性分析

徐冠冰, 王利平, 崔素宁, 张震, 梁雪瑞, 赵洁, 段艳红, 潘鹏涛, 李雪华, 殷俊磊, 职丽娟

河南农业科学 2021, 50 (11): 139-145. DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2021.11.016

摘要（312）

PDF （1993KB）（81）

为探究 ssaV基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响，利用同源重组技术，以pKD3质粒为模板，设计同源臂，扩增外源线性DNA片段，将该片段电转化入含有pKD46的鸡白痢沙门菌C79-13，丢失pKD46后，获得重组菌C79-13 ΔssaV∶∶Cm，将pCP20导入该重组菌，通过筛选获得ssaV 基因缺失株C79-13 ΔssaV，同时构建其回补株C79-13 ΔssaV（pBR322- ssaV），并对突变株C79-13 ΔssaV 的生长特性和生化特性、遗传稳定性及毒力等基本生物学特征进行分析。PCR 扩增和测序结果显示，成功构建了缺失株C79-13 ΔssaV，野生株C79-13、缺失株C79-13 ΔssaV 和回补株C79-13 ΔssaV（pBR322- ssaV）呈现出一致的生长特性和生化特性，突变株C79-13 ΔssaV 的遗传稳定性良好，其在雏鸡体内的定殖能力降低，且口服攻毒后，缺失株C79-13 ΔssaV对雏鸡半数致死量（LD50）至少是野生株（C79-13）的100倍。以上结果表明， ssaV基因与鸡白痢沙门菌的致病性相关，其缺失会明显降低鸡白痢沙门菌的毒力。

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5. 携带NDV HN 基因的减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统构建及其生物学特性分析

宋敏杰, 周小双, 石胜丽, 朱文文, 田文静, 程相朝, 郁川

河南农业科学 2021, 50 (10): 116-123. DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2021.10.015

摘要（180）

PDF （1438KB）（155）

为构建能稳定携带新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）血凝素-神经氨酸酶蛋白（Hemagglutinin‑neuraminidase protein， HN）基因的减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统，从pMD18-T- HN 中扩增出NDV HN 基因，并将其克隆入载体pYA3493- sopE _Nt100 ，构建重组载体pYA3493- sopE _Nt100-HN，然后将其电转化至减毒鼠伤寒沙门菌Δ crpΔ asd SL1344，并对其重组菌的生长特性、遗传稳定性、表达特性和毒力特性等进行分析。结果显示，携带NDV HN 基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌Δ crpΔ asd SL1344（pYA3493-sopENt100- HN）构建成功；重组菌Δ crpΔ asd SL1344（pYA3493- sopE _Nt100- HN）的生长趋势与互补菌ΔcrpΔasd SL1344（pYA3493- sopE _Nt100）和缺失菌Δ crpΔ asd SL1344相似，与亲本菌株SL1344有明显差异；重组菌能够稳定表达HN 基因；减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统能够有效递呈HN 基因，并诱导其在鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）内表达；重组菌的LD50与互补菌和缺失菌没有明显差异，与亲本菌株SL1344差异较大。以上结果表明，成功构建了携带NDV HN 基因的新型减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统Δ crpΔ asd SL1344（pYA3493- sopENt100- HN），能够有效递呈NDV HN 基因并使其高效表达，且安全性高，遗传稳定。

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6. 中和表位串联的PCV2b 病毒样颗粒在昆虫细胞中的表达与鉴定

任春晓, 冯华, 张腾, 蒋敏, 刘运超, 金前跃, 张改平

河南农业科学 2021, 50 (7): 154-160. DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2021.07.018

摘要（224）

PDF （6014KB）（227）

为了研究一种高效的预防猪圆环病毒2b亚型（PCV2b）感染的亚单位疫苗，针对其主要免疫原Cap 蛋白的基因进行分析，将Cap蛋白上重要中和表位226LKDPPLNP233以重复串联的方式连接于cap 基因C 端（capE2），并构建于pFastBacTMⅠ载体上，借助昆虫杆状病毒表达系统进行表达，利用SDS-PAGE、 Western blot分析和动态光散射及透射电镜观察等对重组蛋白CapE2进行鉴定。将纯化的CapE2蛋白免疫小鼠，同时以未连接中和表位的Cap蛋白、PCV2亚单位疫苗和PBS为对照，收集免疫血清分析目的重组蛋白的免疫原性以及连接中和表位对Cap蛋白免疫原性的影响。结果表明，Cap及CapE2蛋白成功在 sf21细胞内表达；纯化后的目的蛋白能够有效地与PCV2单克隆抗体产生特异性反应，并且可以在体外自组装形成均一的、直径约17 nm的病毒样颗粒；血清抗体检测结果显示，在第2次免疫后，CapE2免疫组抗体水平迅速提高，并在3免之后显著高于其他免疫组；中和抗体测定结果表明，Cap及CapE2组血清抗体效价均显著高于疫苗免疫对照组，且CapE2免疫组血清的中和效价可达1∶29。通过昆虫杆状病毒表达系统表达的连接2个中和表位的Cap蛋白，能自组装形成病毒样颗粒，并且具有较好的免疫原性，为PCV2感染的预防提供了新的疫苗候选。

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7. 表达 PCV2 Cap蛋白重组复制缺陷型腺病毒黏膜免疫效果

邓祖丽颖, 刘雨丰, 马宁宁, 陈陆

河南农业科学 2020, 49 (10): 143-148. DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2020.10.020

摘要（76）

PDF （1494KB）（197）

为研发高效的猪圆环病毒 2型(PCV2)黏膜疫苗，通过口服、肌内和滴鼻途径，将表达PCV2 Cap蛋白主要抗原表位的重组复制缺陷型腺病毒（rAd/Cap/518）免疫Balb/c小鼠，同时以无外源基因的空腺病毒（wild-rAd）经滴鼻途径免疫Balb/c小鼠作为对照组，分别检测小鼠血清中IgG和唾液、肺部、肠道灌洗液中IgA抗体水平，脾脏T淋巴细胞亚群及相关细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌水平以及淋巴结、脾脏和肺组织中PCV2病毒载量，评价其黏膜免疫效果。结果显示，与对照组相比，rAd/Cap/518经肌内途径免疫诱导产生的血清IgG抗体水平显著增加；经滴鼻和口服途径免疫诱导产生的局部黏膜部位IgA抗体水平显著增加。rAd/Cap/518经滴鼻、肌内和口服3种途径免疫诱导产生的CD3+T细胞百分率为46.60％~55.65％，经滴鼻免疫诱导产生的 CD3+CD4+T细胞百分率为34.43％~37.29％，经肌内和口服途径免疫诱导产生的CD3+CD4+T细胞百分率为 36.35％~41.58％，经滴鼻途径免疫诱导的CD3+CD8+T细胞百分率为12.39％~18.32％，经口服免疫诱导的CD3+CD8+T细胞百分率为16.29％，均显著高于对照组。rAd/Cap/518经滴鼻途径免疫后，能诱导小鼠脾脏和肠系膜淋巴细胞分泌IFN-γ。攻毒后免疫鼠体内病毒载量显著降低。综上，rAd/Cap/518经肌内途径免疫主要诱导全身性免疫应答，经滴鼻和口服途径免疫能诱导全身性和局部黏膜免疫应答，是一种很有前景的黏膜免疫候选疫苗。