基于二聚体核衣壳蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体iELISA 检测方法建立

doi:10.15933/j.cnki.1004-3268.2024.11.015

河南农业科学 ›› 2024, Vol. 53 ›› Issue (11): 135-146.DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2024.11.015

基于二聚体核衣壳蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体iELISA 检测方法建立

赵啸¹，乔松林²，孙亚宁²，钱祁昇²，李睿²，张改平^1,2

（1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵 712100；2.河南省农业科学院动物疫病防控研究所/动物免疫学重点实验室，河南郑州 450002）

收稿日期:2024-03-04 出版日期:2024-11-15 发布日期:2024-12-19
通讯作者: 张改平（1960-），男，河南内黄人，研究员，博士，主要从事重大疫病快速检测技术与疫苗研究。E-mail：zhanggaiping2003@163.com 李睿（1986-），男，河南郑州人，副研究员，博士，主要从事猪繁殖与呼吸综合征等致病机制研究。E-mail：lirui860620@sina.com
作者简介:赵啸（1998-），女，陕西西安人，硕士，主要从事预防兽医方面研究。E-mail：1065379196@qq.com
基金资助:
河南省重大科技专项（221100110600-03）；国家生猪产业技术体系项目（CARS-35）；河南省现代农业（生猪）产业技术体系
项目（HARS-22-12-S）

Development of Indirect Enzyme‑Linked Immunosorbent Assay Based on the Dimeric Nucleocapsid Protein for Detecting Antibodies against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

ZHAO Xiao¹，QIAO Songlin²，SUN Yaning²，QIAN Qisheng²，LI Rui²，ZHANG Gaiping^1,2

（1.College of Veterinary Medicine，Northwest A & F University，Yangling 712100，China；2.Institute for Animal Health，
Henan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Animal Immunology，Zhengzhou 450002，China）

Received:2024-03-04 Published:2024-11-15 Online:2024-12-19

摘要/Abstract

摘要： 为制备稳定性好、免疫反应性佳的核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，N），设计表达二聚体N蛋白（N-dimer），并基于该蛋白质建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）抗体间接酶联免疫吸附试验（Indirect enzyme‑linked immunosorbent assay，iELISA）检测方法。首先选取当前PRRSV国内优势毒株NADC30-like N蛋白基因序列，通过（GGGGS）3 linker将N蛋白基因序列串联，经密码子优化合成后构建N-dimer重组表达载体。利用原核表达系统进行诱导表达，并通过镍离子螯合亲和层析法进行纯化。Western-blot分析其与PRRSV阳性和阴性血清的反应性；冻融法比较N-dimer与单体N蛋白（N-monomer）的沉淀析出情况；ELISA法比较N-dimer与N-monomer的免疫反应性。以N-dimer作为包被抗原建立PRRSV抗体iELISA检测方法，对该方法的反应条件进行优化，验证其特异性、敏感性、重复性，并应用于临床血清样品检测。结果表明，在16 ℃、0.2 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷条件下诱导16 h，N-dimer获得大量可溶性表达。Western-blot结果表明，N-dimer能够与PRRSV阳性血清发生特异性反应；相较于N-monomer，N-dimer能够稳定保存，并且免疫反应性更佳。成功建立了基于N-dimer的PRRSV抗体iELISA检测方法，且该方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性；与商业试剂盒结果进行比较，其阳性符合率为96.88%，总符合率为96.86%，符合率高。综上，成功制备了稳定性好、免疫反应性佳的N-dimer，并基于N-dimer建立了PRRSV抗体iELISA检测方法。

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒, 核衣壳蛋白, 二聚体, 间接ELISA, 临床检测

Abstract: In order to prepare N protein with good stability and immunoreactivity，N‑dimer was designed and expressed，and an iELISA detection method for PRRSV antibody was established based on this protein.Firstly，the NADC30‑like N protein gene sequence of the current dominant PRRSV strain in China was selected，and the N protein gene sequence was concatenated through a（GGGGS）3 linker.After codon optimization and synthesis，an N‑dimer recombinant expression vector was constructed.The recombinant protein was expressed using prokaryotic expression system and purified by nickel ion chelation affinity chromatography.Its reactivity with PRRSV positive and negative sera was analyzed by Western‑blot.Its stability after freezing and thawing and immunoreactivity were further compared with those of N‑monomer.An iELISA was subsequently developed based on N‑dimer as coating antigen，and evaluated for the specificity，sensitivity，and repeatability.The developed iELISA was finally applied to clinical serum sample detection.The results showed that under the conditions of 16 ℃ and 0.2 mmol/L isopropylthiogalactoside，N‑dimer was obtained with a large amount of soluble expression after 16 hours of induction.Western‑blot results showed that N‑dimer could specifically react with PRRSV positive serum；Compared to N‑monomer，N‑dimer coule be stably stored and had better immunoreactivity.We successfully established a PRRSV antibody iELISA detection method based on N‑dimer，which had good specificity，sensitivity，and repeatability；Compared with the results of commercial test kits，the positive agreement rate was 96.88%，and the overall agreement rate was 96.86%，indicating a high agreement rate.In summary，this study successfully prepared N‑dimer with good stability and excellent immunoreactivity；A PRRSV antibody iELISA detection method was established based on N‑dimer.

Key words: PRRSV, N protein, Dimer, iELISA, Clinical detection

中图分类号:

S858.28

赵啸, 乔松林, 孙亚宁, 钱祁昇, 李睿, 张改平. 基于二聚体核衣壳蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体iELISA 检测方法建立[J]. 河南农业科学, 2024, 53(11): 135-146.

ZHAO Xiao, QIAO Songlin, SUN Yaning, QIAN Qisheng, LI Rui, ZHANG Gaiping. Development of Indirect Enzyme‑Linked Immunosorbent Assay Based on the Dimeric Nucleocapsid Protein for Detecting Antibodies against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2024, 53(11): 135-146.

参考文献

［1］刘光清，蔡雪晖，仇华吉，等.猪繁殖与呼吸综合征的研究进展［J］.中国预防兽医学报，2001，23（1）：72‑76.

LIU G Q，CAI X H，QIU H J，et al.Research progress of porcine reproductive and respiratory syndrome［J］.Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2001，23（1）：72‑76.

［2］DONE S H，PATON D J. Porcine reproductive and respiratory syndrome：Clinical disease，pathology and immunosuppression［J］.Veterinary Record，1995，136 （2）：32‑35.

［3］郭宝清，陈章水，刘文兴，等.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究［J］.中国畜禽传染病，1996，18（2）：1‑5.

GUO B Q，CHEN Z S，LIU W X，et al.Isolation and identification of porcine reproductory and respiratory syndrome（PRRS）virus from aborted fetuses suspected of PRRS［J］.Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，1996，18（2）：1‑5.

［4］WALKER P J，SIDDELL S G，LEFKOWITZ E J，et al.Changes to virus taxonomy and to the international code of virus classification and nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses（2021）［J］.Archives of Virology，2021，166（9）：2633‑2648.

［5］KUHN J H，LAUCK M，BAILEY A L，et al.Reorganization and expansion of the nidoviral family Arteriviridae［J］.Archives of Virology，2016，161（3）：755‑768.

［6］YU Y，ZHANG Q Y，CAO Z，et al.Recent advances in porcine reproductive and respiratory syndrome virus NADC30‑like research in China：Molecular characterization，pathogenicity，and control［J］.Frontiers in Microbiology，2022，12：791313.

［7］XIANG L R，XU H，LI C，et al.Long‑term genome monitoring retraces the evolution of novel emerging porcine reproductive and respiratory syndrome viruses［J］.Frontiers in Microbiology，2022，13：885015.

［8］BARBARA E，JEFFERY J，SYLVIE D，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome vrius［J］.Diseases of Swine，2008，9（1）：428‑463.

［9］FANG Y，SNIJDER E J.The PRRSV replicase：Exploring the multifunctionality of an intriguing set of nonstructural proteins［J］.Virus Research，2010，154（1/2）：61‑76.

［10］VEIT M，MATCZUK A K，SINHADRI B C，et al.Membrane proteins of arterivirus particles：Structure，topology，processing and function［J］.Virus Research，2014，194：16‑36.

［11］陈旭，汤德元，曾智勇，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白和非结构蛋白研究进展［J］.动物医学进展，2023，44（9）：76‑81.

CHEN X，TANG D Y，ZENG Z Y，et al.Progress on structural and nonstructural proteins of porcine reproductive and eespiratory syndrome virus［J］.Progress in Veterinary Medicine，2023，44（9）：76‑81.

［12］MARDASSI H，MASSIE B，DEA S.Intracellular synthesis，processing，and transport of proteins encoded by ORFs 5 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］. Virology，1996，221（1）：98‑112.

［13］DEA S，GAGNON C A，MARDASSI H，et al.Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome（PRRS）virus：Comparison of the North American and European isolates［J］.Archives of Virology，2000，145（4）：659‑688.

［14］MEULENBERG J J，BENDE R J，POL J M，et al.Nucleocapsid protein N of Lelystad virus：Expression by recombinant baculovirus，immunological properties，and suitability for detection of serum antibodies［J］.Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，1995，2（6）：652‑656.

［15］WOOTTON S K，YOO D.Homo‑oligomerization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein and the role of disulfide linkages［J］.Journal of Virology，2003，77（8）：4546‑4557.

［16］DOAN D N P，DOKLAND T. Structure of the nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］. Structure，2003，11 （11）：1445‑1451.

［17］SPILMAN M S，WELBON C，NELSON E，et al.Cryo‑electron tomography of porcine reproductive and respiratory syndrome virus： Organization of the nucleocapsid［J］.Journal of General Virology，2009，90 （Pt 3）：527‑535.

［18］JOURDAN S S，OSORIO F A，HISCOX J A.Biophysical characterisation of the nucleocapsid protein from a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2012，419 （2）：137‑141.

［19］黄金海，杨汉春，郭鑫，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的原核表达、纯化与结构分析［J］.微生物学报，2004，44（6）：737‑740.
HUANG J H，YANG H C，GUO X，et al.Purification and structural analysis of the nucleocapsid of PRRS virus expressed from Escherichia coli［J］.Acta Microbiologica Sinica，2004，44（6）：737‑740.

［20］邵烈刚.猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备［D］.重庆：西南大学，2009.
SHAO L G.Preparation of monoclonal antibodies against nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus［D］.Chongqing：Southwest University，2009.

［21］吴国平，郭川，曹敏杰，等.原核高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的特性及应用［J］.中国兽医学报，2007，27（2）：150‑154.
WU G P，GUO C，CAO M J，et al.Characterization and application of nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressed in E.coli［J］.Chinese Journal of Veterinary Science，2007，27（2）：150‑154.

［22］HOLTKAMP D，KLIEBENSTEIN J，NEUMANN E，et al.Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers［J］.Journal of Swine Health and Production，2013，21（2）：72‑84.

［23］ZHOU L，YANG H C.Porcine reproductive and respiratory syndrome in China［J］. Virus Research，2010，154（1/2）：31‑37.

［24］王久媛. 猪繁殖与呼吸综合征几种常用检测方法比较［J］.现代农业，2017（4）：83.
WANG J Y.Comparison of several commonly used detection methods for porcine reproductive and respiratory syndrome［J］.Modern Agriculture，2017 （4）：83.

［25］李华玮，黄岚，赵孟孟，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒及其检测方法概述［J］.动物医学进展，2020，41（7）：120‑124.
LI H W，HUANG L，ZHAO M M，et al.Induction to detection methods of porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Progress in Veterinary Medicine，2020，41（7）：120‑124.

［26］鑫婷，侯绍华，贾红，等.猪呼吸与繁殖综合症病毒RT-LAMP检测方法的建立［J］.中国农业科学，2010，43（1）：185‑191.
XIN T，HOU S H，JIA H，et al.Development of a novel RT‑LAMP assay for porcine reproductive and
respiratory syndrome virus［J］. Scientia Agricultura Sinica，2010，43（1）：185‑191.

［27］ALBINA E，LEFORBAN Y，BARON T，et al.An enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）for the detection of antibodies to the porcine reproductive and respiratory syndrome（PRRS） virus［J］.Annales de Recherches Veterinaires Annals of Veterinary Research，1992，23（2）：167‑176.

［28］阮周曦，杨俊兴，黄韫，等.4种检测猪繁殖与呼吸综合征抗体间接ELISA试剂盒的比较［J］.中国口岸科学技术，2020，2（6）：40‑45.
RUAN Z X，YANG J X，HUANG Y，et al.Comparison of 4 types indirect ELISA kits for detecting porcine
reproductive & respiratory syndrome［J］.China Port Science and Technology，2020，2（6）：40‑45.

［29］李乃果，贾松涛.不同进口蓝耳病病原抗体ELISA检测试剂盒比较及应用浅析［J］.中国猪业，2019，14 （5）：82‑84.
LI N G，JIA S T.Comparison and application of different imported ELISA detection kits for pathogenic antibody of blue ear disease［J］.China Swine Industry，2019，14（5）：82‑84.

［30］WITTE S B，CHARD‑BERGSTROM C，LOUGHIN T A，et al.Development of a recombinant nucleoprotein‑based enzyme‑linked immunosorbent assay for quantification of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，2000，7（4）：700‑702.

［31］王云峰，周艳君，仇华吉，等.猪繁殖与呼吸综合征重组核衣壳蛋白（N）-ELISA诊断方法的建立与应用［J］.中国预防兽医学报，2000，22（S1）：127‑130.
WANG Y F，ZHOU Y J，QIU H J，et al.Establishment and application of enzyme‑linked immunosorbent assay based on recombinant nucleocapsid protein for diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome［J］.Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2000，22（S1）：127‑130.

［32］刘庆庆，吴鹏，李培东，等.表达猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的重组腺病毒的构建及其免疫原性分析［J］.中国畜牧兽医，2022，49（3）：1024‑1031.
LIU Q Q，WU P，LI P D，et al. Construction of recombinant adenovirus expressing porcine reproductive and respiratory syndrome virus N protein and its immunogenicity analysis［J］.China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，2022，49（3）：1024‑1031.

［33］廖立珊，曾少灵，孙洁，等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因真核表达载体的构建及表达［J］. 动物医学进展，2014，35（9）：25‑28.
LIAO L S，ZENG S L，SUN J，et al.Construction ofeukaryotic expression vector and expression of N gene of HP‑PRRSV［J］.Progress in Veterinary Medicine，2014，35（9）：25‑28.

［34］FERRIN N H，FANG Y，JOHNSON C R，et al.Validation of a blocking enzyme‑linked immunosorbent assay for detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，2004，11（3）：503‑514.

［35］史雪盟，王靖仪，陈帅武，等.重组ABHD17A的表达及功能验证［J/OL］.河南农业大学学报，2024：1‑14［2024‑02‑16］. https：//doi.org/10.16445/j.cnki.1000‑2340.20240227.002.
SHI X M，WANG J Y，CHEN S B，et al.Expression and functional verification of recombinant ABHD17A ［J/OL］.Journal of Henan Agricultural University，2024：1‑14［2024‑02‑16］. https：//doi.org/10.16445/j.cnki. 1000‑2340. 20240227. 002.

［36］刘海静，田星，王露，等.毛果杨多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白家族PtPGIP的生物信息学分析［J］.山西农业科学，2023，51（8）：852‑860.
LIU H J，TIAN X，WANG L，et al.Bioinformatics analysis of polygalacturonase‑inhibitor protein family PtPGIP in Populus trichocarpa［J］.Journal of Shanxi Agricultural Sciences，2023，51（8）：852‑860.

［37］莫红芳，石宗承，陆晶山，等.猪塞内卡谷病毒VP1蛋白原核表达及多克隆抗体制备［J］.南方农业学报，2023，54（7）：2175‑2183.
MO H F，SHI Z C，LU J S，et al.Prokaryotic expression of porcine Seneca valley virus VP1 protein and preparation of polyclonal antibody［J］.Journal of Southern Agriculture，2023，54（7）：2175‑2183.
［38］王清龙，王瑞宁，王勋，等.猪伪狂犬病病毒gE蛋白的真核表达及其活性鉴定［J］.河南农业科学，2023，52（3）：127‑134.
WANG Q L，WANG R N，WANG X，et al.Eukaryotic expression of porcine pseudorabies virus gE protein and identification of its activity［J］.Journal of Henan Agricultural Sciences，2023，52（3）：127‑134.
［39］祁元明，陈玉梅，王爱萍.非洲猪瘟病毒特异性抗体检测研究进展［J］.河南农业大学学报，2021，55（5）：807‑814.
QI Y M，CHEN Y M，WANG A P.Advances in detection of specific antibodies against African swine fever virus［J］.Journal of Henan Agricultural University，2021，55（5）：807‑814.
［40］DOAN D N P，DOKLAND T.Cloning，expression，purification，crystallization and preliminary X‑ray diffraction analysis of the structural domain of the nucleocapsid N protein from porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）［J］.Acta Crystallographica Section D，Biological Crystallography，2003，59（Pt 8）：1504‑1506.
［41］王俊，代军飞，马炳，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核可溶性表达和间接ELISA抗体检测方法的初步建立［J］.中国兽医科学，2018，48（4）：419‑427.
WANG J，DAI J F，MA B，et al.Soluble prokaryotic expression of nucleocapside protein encoding gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and the primary establishment of indirect ELISA for the detection of serum antibodies against PRRSV［J］.Chinese Veterinary Science，2018，48（4）：419‑427.

[1]	李鹏, 雷梦瑶, 冯丽丽, 王振伟, 管春晓, 郑洪双, 王俊茹, 王利平, 李炎锦, 吴欣媛, 刘兴友, 金前跃. 基于Penton 蛋白禽腺病毒血清4 型间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 河南农业科学, 2024, 53(7): 133-141.
[2]	李鹏, 王俊茹, 冯丽丽, 王华健, 安娜, 雷梦瑶, 郑洪双, 王利平, 刘兴友. 艾草固态发酵工艺优化及其对PRRSV 抑制作用研究[J]. 河南农业科学, 2024, 53(6): 128-137.
[3]	方剑玉, 张青娴, 郎利敏, 徐彬, 王改利, 席燕燕, 冯现明, 王克领, 李绍钰. 猪IFN-α8 的原核表达及抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性研究[J]. 河南农业科学, 2023, 52(9): 141-147.
[4]	张小霞, 杨艳青, 王秋云, 杜俊阳, 曹瀚文, 梁振普. 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145 细胞的长链非编码RNA 和mRNA 转录组分析[J]. 河南农业科学, 2023, 52(4): 127-136.
[5]	郭占达, 杜季梅, 郭子仪, 王新港, 张彦华. 2020 年河南省猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查及ORF5 基因变异分析[J]. 河南农业科学, 2022, 51(3): 146-153.
[6]	王丽, 冯丽丽, 张雨杭, 孙亚宁, 杨继飞, 赵东, 王瑞宁, 李学伍, 郭军庆, 张改平. 猪瘟病毒E^rns/E2融合蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及评价[J]. 河南农业科学, 2021, 50(4): 154-161.
[7]	周新宇, 陈鑫鑫, 乔松林, 郭振华, 李睿, 邓瑞广, 张改平. 猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株与JXA1-R疫苗株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立及应用[J]. 河南农业科学, 2021, 50(1): 142-151.
[8]	鲍印, 翟洪月, 李慧敏, 袁志乔, 马玉静, 丁雨善, 阚云超, 姚伦广, 田志军, 冷超粮. 豫西南猪主要病毒性传染病流行病学调查[J]. 河南农业科学, 2021, 50(1): 152-157.
[9]	秦枫, 刘云, 吴植, 吴双, 郭长明, 顾玲玲, 吴晓洁, 朱善元. 蜘蛛香提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用[J]. 河南农业科学, 2020, 49(10): 149-155.
[10]	郭东光, 陈明艳, 朱艳平, 李鹏, 岳锋, 崔芳微, 李文明, 王金海, 王选年. 猪瘟病毒结构蛋白E0抗体间接ELISA检测方法的建立及优化[J]. 河南农业科学, 2019, 48(11): 151-156.
[11]	刘云, 朱善元, 龚祝南, 秦枫, 夏文龙, 吴双, 吴晓洁. 6种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用[J]. 河南农业科学, 2019, 48(10): 147-154.
[12]	方剑玉，朱文豪，郭小参，白献晓，李海利，徐引弟，郎利敏，王治方. 表达猪Viperin蛋白重组腺病毒的构建及其对PRRSV复制的抑制作用[J]. 河南农业科学, 2017, 46(9): 126-131.
[13]	崔丹丹，王傲杰，王新港，周峰，彭志锋，王川庆. 1株PRRSV类NADC30毒株的分离鉴定及序列分析[J]. 河南农业科学, 2017, 46(9): 132-138.
[14]	关淼，赵晓彤，曹东，顾贵波，杨本勇，李树博，申贯男，魏萍. 辽宁地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因的遗传变异分析[J]. 河南农业科学, 2017, 46(8): 137-141,146.
[15]	王林建，郭振华，乔松林，陈鑫鑫，张改平. 河南地区NADC30-like PRRSV毒株的增值特性与遗传进化分析[J]. 河南农业科学, 2017, 46(3): 122-128.

基于二聚体核衣壳蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体iELISA 检测方法建立

Development of Indirect Enzyme‑Linked Immunosorbent Assay Based on the Dimeric Nucleocapsid Protein for Detecting Antibodies against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

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