红花查尔酮合成酶基因的克隆、结构及表达分析

doi:10.15933/j.cnki.1004-3268.2022.09.006

摘要/Abstract

摘要： 黄酮类物质是红花的主要活性成分，查尔酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）是黄酮类物质合成过程中的关键限速酶。为解析红花黄酮类物质的合成途径，以大果球红花为材料，通过逆转录PCR（RT-PCR）及PCR技术克隆红花CHS（CtCHS）基因的cDNA和gDNA序列，分析其基因结构、蛋白质结构和系统进化关系，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析CtCHS 基因的组织表达模式及激素处理下的表达模式。结果表明，CtCHS基因的cDNA序列长1 317 bp，gDNA序列长1 815 bp，由2个外显子和1个内含子构成。内含子AT含量明显高于GC含量，且明显高于外显子中AT含量，内含子序列含有类似增强子及光照、干旱胁迫响应的顺式作用元件，可能在增强基因转录中发挥作用，并可能受光照、干旱等胁迫的诱导。该基因的cDNA序列包含1个1 206 bp的最大开放阅读框，编码401个氨基酸，相应的蛋白质为亲水性蛋白，无信号肽序列，不存在跨膜结构，定位于细胞质。药用植物CHS系统进化分析结果表明，CtCHS与矢车菊CHS的进化关系最近，与白芨、铁皮石斛等CHS的进化关系较远，且药用植物CHS蛋白具有明显的种属特性。qRT-PCR检测结果表明，CtCHS在花中的表达量最高，初期果球和幼根中的表达量最低。不同花期，红色和白色红花中CtCHS基因的表达量呈现相同的表达趋势，均在盛花期表达量最高，但红色红花在花组织形成后期表达量最低，而白色红花在花瓣开始伸出期表达量最低。另外，CtCHS基因的表达量在红色和白色红花花组织形成初期、后期及幼茎和幼叶中差异显著，在花瓣基本伸出期差异极显著，而在其他时期、其他组织中差异不显著。激素胁迫后的表达量检测结果表明，CtCHS可响应不同外源激素处理，从而影响其表达。

关键词: 红花, 查尔酮合成酶, 基因结构, 内含子, 表达分析

Abstract: Chalcone synthase（CHS）is the key rate⁃limiting enzyme in the biosynthesis of flavonoids，which are the main bioactive components of Carthamus tinctorius L..In order to elucidate the synthetic pathway of flavonoids in Carthamus tinctorius L.，the cDNA sequence and gDNA sequence of CtCHS gene were obtained by RT⁃PCR and PCR using safflower cultivar as material，the gene structure，protein structure，phylogeny were analyzed，and the expression patterns of CtCHS in different tissues，and underdifferent exogenous hormone treatments were detected by qRT⁃PCR. The results showed that the length of CtCHS cDNA was 1 317 bp，and gDNA was 1 815 bp，which consisted of two exons and one intron.The content of AT in intron was significantly higher than that of GC，and was significantly higher than that of AT in exon.In addition，the intron sequence contained cis acting elements similar to enhancers，light and drought stress responsers，which might play a role in enhancing gene transcription and might be induced by light or drought stress.The cDNA sequence of CtCHS gene contained a maximum open reading frame of 1 206 bp，encoding 401 amino acids.The corresponding protein was hydrophilic protein，had no signal peptide sequence and transmembrane structure，and was localized in cytoplasm. The results of phylogenetic analysis of CHS in pharmaceutical plants showed that the CtCHS protein had the closest evolutionary relationship with CHS of Centaurea cyanus，but had a distant evolutionary relationship with CHS of Bletilla striata and Dendrobium candidum.Besides CHS proteins of pharmaceutical plants had obvious species characteristics.The results of qRT⁃PCR showed that the expression of CtCHS was the highest in flowers and the lowest in early fruit balls and young roots.At different stages of flower development，the expression level of CtCHS gene showed the same trend in the two Carthamus tinctorius L.varieties（red and white cultivars），and both had the highest expression level at blooming stage.However，the red cultivars had the lowest expression level at late stage of flower tissue formation，while the white cultivar had the lowest expression level at petal initial extending stage.In addition，the expression of CtCHS gene was significantly different between red and white safflower cultivars in initial stage of flower tissue formation，late stage of flower tissue formation，young stems and young leaves，and the difference in petal basically extending stage was extremely significant，while the difference in other stages and other tissues was not significant.The expression analysis of CtCHS after hormone stress showed that CtCHS could respond to different exogenous hormone treatments，thus affecting its expression.

Key words: Carthamus tinctorius L. , Chalcone synthase, Gene structure, Intron, Expression analysis

中图分类号:

S567.2

鲁丹丹, 谭政委, 杨红旗, 李磊, 余永亮, 许兰杰, 杨青, 梁慧珍. 红花查尔酮合成酶基因的克隆、结构及表达分析[J]. 河南农业科学, 2022, 51(9): 56-67.

LU Dandan, TAN Zhengwei, YANG Hongqi, LI Lei, YU Yongliang, XU Lanjie, YANG Qing, LIANG Huizhen. Cloning，Structure and Expression Analysis of Chalcone Synthase Gene from Carthamus tinctorius L.[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2022, 51(9): 56-67.

参考文献

［1］BARREDA V D，PALAZZESI L，TELLERIA M C，et al.Early evolution of the angiosperm clade Asteraceae in the Cretaceous of Antarctica［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112（35）：10989‐10994.

［2］李春花，加央多拉，田娟，等.自交可育红花甜荞种质资源创新利用研究［J］.南方农业学报，2021，52（10）：2751‐2757.

LI C H，JIAYANGDUOLA，TIAN J，et al.Innovation utilization of germplasm resources of self‐fertile safflower buckwheat［J］.Journal of Southern Agriculture，2021，52 （10）：2751‐2757.

［3］许兰杰，梁慧珍，余永亮，等.红花花器官形态与小孢子发育时期的关系研究［J］.河南农业科学，2021，50 （11）：55‐61.

XU L J，LIANG H Z，YU Y L，et al.Relationship between floral organ morphology and microspore development period in safflower［J］.Journal of Henan Agricultural Sciences，2021，50（11）：55‐61.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典：第一卷［S］. 北京：中国医药科技出版社，2020：158.

Chinese Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China：Vol Ⅰ［S］.Beijing：China Medical Science Press，2020：158.

［5］SI W，YANG W H，GUO D D，et al.Selective ion monitoring of quinochalcone C‐glycoside markers for the simultaneous identification of Carthamus tinctorius L. in eleven Chinese patent medicines by UHPLC/QTOFMS［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2016，117：510‐521.

［6］LU J X，ZHANG C X，HU Y，et al.Application of multiple chemical and biological approaches for quality assessment of Carthamus tinctorius L.（safflower）by determining both the primary and secondary metabolites［J］.Phytomedicine，2019，58：152826.

［7］VIDOVI M，MORINA F，MILIC S，et al.Carbon allocation from source to sink leaf tissue in relation to flavonoid biosynthesis in variegated Pelargonium zonale under UV‐B radiation and high PAR intensity［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2015，93：44‐55.

［8］WANG C H，LIU C，LIU J，et al.Antioxidant activity of medicine mulberry（Morusnigra）in Xinjiang［J］.Scientia Silvae Sinicae，2014，50（8）：53‐59.

［9］张方.黄酮类化合物药理作用的探讨［J］.饮食保健， 2020，7（7）：23.

ZHANG F.Study on pharmacological action of flavonoids［J］.Diet Health，2020，7（7）：23.

［10］邱梦瑜，何子靖，张衍馨，等.黄皮与山黄皮不同部位黄酮、多酚含量及抗氧化活性比较［J/OL］.南方农业学报，2022：1‐15［2022‐09‐13］.http：//kns.cnki.net/kcms/detail/45.1381.s.20220322.1551.004.Html.

QIU M Y，HE Z J，ZHANG Y X，et al.Comparison of flavonoids， polyphenols contents and antioxidant activities in different cultivars and parts of Clausena lansium and Clausena anisum‑olens［J/OL］. Journal of Southern Agriculture，2022：1‐15［2022‐09‐13］.http：// kns.cnki.net/kcms/detail/45.1381.s.20220322. 1551.004.Html.

［11］薛鹤，曾阳，李锦萍，等.金露梅黄酮提取工艺的响应面优化及其抗氧化和降血糖活性分析［J］.南方农业学报，2022，53（2）：505‐515.

XUE H，ZENG Y，LI J P，et al.Optimization foextraction process of flavonoids from Potentilla fruticosa L.by response surface method and the analysis of its antioxidant and hypoglycemic activities［J］.Journal of Southern Agriculture，2022，53（2）： 505‐515.

［12］TOHIDI B，RAHIMMALEK M，ARZANI A.Essential oil composition，total phenolic，flavonoid contents，and antioxidant activity of Thymus species collected from different regions of Iran［J］.Food Chemistry，2017，220：153‐161. ［13］TOHGE T，DE SOUZA L P，FERNIE A R.Current understanding of the pathways of flavonoid biosynthesis in model and crop plants［J］.Journal of Experimental Botany，2017，68（15）：4013‐4028.

［14］PANDITH S A，RAMAZAN S，KHAN M I，et al.Chalcone synthases（CHSs）：The symbolic type Ⅲ polyketide synthases［J］.Planta，2020，251（1）：15.

［15］孟衡玲，张薇，卢丙越，等.铁皮石斛查尔酮合酶基因克隆与表达分析［J］.南方农业学报，2016，47（12）：2015‐2019.

MENG H L，ZHANG W，LU B Y，et al.Cloning and expression of chalcone synthase gene from Dendrobium officinale［J］.Journal of Southern Agriculture，2016，47 （12）：2015‐ 2019.

［16］谭永佳，陈静，张林，等.艾纳香BbCHS基因的克隆及其原核表达载体的构建［J］.分子植物育种，2020，18 （11）：3598‐3603.

TAN Y J，CHEN J，ZHANG L，et al.Gene cloning of BbCHS in Blumea balsamifera DC.and its construction of prokaryotic expression vector［J］.Molecular Plant Breeding，2020，18（11）：3598‐3603.

［17］朱宇佳，王慧中，郭宏，等.苦蘵查尔酮合成酶编码基因（PaCHS1）的克隆及表达谱分析［J］.浙江农业科学，2018，59（5）：757‐762，764.

ZHU Y J，WANG H Z，GUO H，et al.Cloning and expression analysis of chalcone synthase gene PaCHS1 from Physalis angulata L.［J］.Zhejiang Agricultural Sciences，2018，59（5）：757‐762，764.

［18］田爱梅，许忠民，张恩慧.白芨查尔酮合成酶基因的克隆与分析［J］.西北农业学报，2014，23（7）：91‐95.

TIAN A M，XU Z M，ZHANG E H.Isolation and molecular characterization of BsCHS gene from Bletilla striata［J］.Acta Agriculturae Boreali‐Occidentalis Sinica，2014，23（7）：91‐95.

［19］HAN Y H，CAO Y P，JIANG H Y，et al.Genome‐wide dissection of the chalcone synthase gene family in Oryza sativa［J］.Molecular Breeding，2017，37（10）： 119‐131.

［20］HAN Y H，DING T，BO S，et al.Genome‐wide identification，characterization and expression analysis of the chalcone synthase family in maize［J］.International Journal of Molecular Sciences，2016，17 （2）：161.

［21］KONG X J，KHAN A，LI Z L，et al.Identification of chalcone synthase genes and their expression patterns reveal pollen abortion in cotton［J］.Saudi Journal of Biological Sciences，2020，27（12）：3691‐3699.

［22］王文举，于胜晓，岑光莉，等.甘蔗查尔酮合成酶基因的挖掘、序列分析及表达分析［J］.分子植物育种， 2020，18（22）：108‐119.

WANG W J，YU S X，CEN G L，et al.Sequence analysis and expression of chalcone synthase genes in Sugarcane［J］.Molecular Plant Breeding，2020，18（22）：108‐119.

［23］WU Z H，LIU H，ZHAN W，et al.The chromosome‐scale reference genome of safflower（Carthamus tinctorius） provides insights into linoleic acid and flavonoid biosynthesis［J］.Plant Biotechnology Journal，2021，19 （9）：1725‐1742.

［24］SHINOZAKI J，KENMOKU H，NIHEI K，et al.Cloning and functional analysis of three chalcone synthases from the flowers of safflowers Carthamus tinctorius［J］.Natural Product Communications，2016，11（6）： 787‐790.

［25］刘秀明，陆皖行，李佳，等.红花CHS基因的过表达提高了拟南芥黄酮含量［J］.中国细胞生物学学报，2017，39（2）：182‐190.

LIU X M，LU W H，LI J，et al.Over‐expression of chalconesynthase of safflower increases flavonoid content in Arabidopsis thaliana［J］.Chinese Journal of Cell Biology，2017，39（2）：182‐190.

［26］何贝轩，薛英茹，涂燕华，等.CtCHS4响应茉莉酸甲酯诱导促进了红花醌式查尔酮类化合物的积累［J］.药学学报，2018，53（4）：636‐645.

HE B X，XUE Y R，TU Y H，et al.CtCHS4 induces the accumulation of safflower quinine chalcones in response to methyl jasmonate induction［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2018，53（4）：636‐645.

［27］王艳芳.红花天冬氨酸代谢途径关键酶基因的挖掘及功能鉴定［D］. 长春：吉林农业大学，2016.

WANG Y F.Excavation and functional identification of the gene encoding key enzyme of aspirate metbolism pathway in safflower grain［D］.Changchun：Jilin Agricultural University，2016.

［28］BLENCOWE B J.Alternative splicing：New insights from global analyses［J］.Cell，2006，23（10）：37‐47.

［29］陈兵，文建凡.内含子在生物信息学研究和基因工程中的应用［J］.生命的化学，2010，30（1）：59‐63.

CHEN B，WEN J F.Application of intron in bioinformatics researches and transgenic engineering［J］.Chemistry of Life，2010，30（1）：59‐63.

［30］EMAMI S，ARUMAINAYAGAM D，KORF I，et al.The effects of a stimulating intron on the expression of heterologous genes in Arabidopsis thaliana［J］.Plant Biotechnology Journal，2013，11（5）：555‐563.

［31］SOMMER H，SAEDLER H.Structure of the chalcone synthase gene of Antirrhinum majus［J］.Molecular and General Genetics，1986，202（3）：429‐434.

［32］李文静，孙艳香，付亚娟，等.菊芋查尔酮合成酶基因的克隆与表达分析［J］.西北农业学报，2020，29（4）： 603‐612.

LI W J，SUN Y X，FU Y J，et al.Cloning and expression analysis of chalcone synthase gene from Helianthus tuberosus［J］.Acta Agricultura Boreali‐Occidentalis Sinica，2020，29（4）：603‐612.

［33］许明，林世强，倪冬昕，等.藤茶查尔酮合成酶基因 AgCHS1的克隆及功能鉴定［J］.中国农业科学，2020， 53（24）：5091‐5103.

XU M，LIN S Q，NI D X，et al.Cloning and function characterization of chalcone synthase gene AgCHS1 in Ampelopsis grossedentata［J］.Scientia Agricultura Sinica，2020，53（24）：5091‐5103.

［34］张太奎，刘峥，朱芳明，等.10种观赏植物查尔酮合成酶基因生物信息学分析［J］.西部林业科学，2013，42 （5）：62‐68.

ZHANG T K，LIU Z，ZHU F M，et al.Bioinformatics analysis of chalcone synthase genes from ten kinds of ornamental plants［J］.Journal of West China Forestry Science，2013，42（5）：62‐68.

［35］SASLOWSKY D，WINKEL‐SHIRLEY B.Localization of flavonoid enzymes in Arabidopsis roots［J］.Plant Journal，2001，27（1）：37‐48.

［36］TIAN L，WAN S B，PAN Q H，et al.A novel plastid localization of chalcone synthase in developing grape berry［J］.Plant Science，2008，175（3）：431‐436.

［37］WANG C H，ZHI S，LIU C Y，et al.Isolation and characterization of a novel chalcone synthase gene family from mulberry［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2017，115：107‐118.

［38］马立功，张匀华，孟庆林，等.向日葵查尔酮合酶 HaCHS基因的克隆与逆境应答［J］.中国油料作物学报，2016，38（1）：19‐26.

MA L G，ZHANG Y H，MENG Q L，et al.Cloning and stress response of chalcone synthase gene in sunflower （Helianthus annuus）［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2016，38（1）：19‐26.

［39］薛英茹.红花黄酮类生物合成途径查尔酮合酶基因的功能研究［D］.上海：第二军医大学，2017.

XUE Y R.Flavonoids biosynthesis pathway chalcone synthase genes function research in Carthamus tinctorius L.［D］.Shanghai：Naval Medical University， 2017.

[1]	王川艺, 黄红涛, 陈发波, 郑张飞, 方平. 胭脂萝卜RsCHS1 基因克隆及表达分析[J]. 河南农业科学, 2023, 52(9): 122-132.
[2]	高文, 闫庚洋, 左俊凯, 许乐, 侯蕊利, 景其昌, 任昊. 蜀葵ArbHLH148 基因克隆与表达分析[J]. 河南农业科学, 2023, 52(9): 133-140.
[3]	崔小月, 尚泓泉, 吕中伟, 娄玉穗, 张柯. 欧洲葡萄VvCAX 基因家族的鉴定与表达分析[J]. 河南农业科学, 2023, 52(11): 113-123.
[4]	杨翠凤, 滕峥, 韦春, 刘正鲁. 百香果苯丙氨酸解氨酶基因PePAL克隆及表达分析[J]. 河南农业科学, 2023, 52(10): 100-108.
[5]	谢羽恬, 张新业, 苏彦苹, 吴双, 张泽银, 褚卓栋, 冯雪, 孙艳香. 猕猴桃多胺氧化酶基因家族的鉴定及表达分析[J]. 河南农业科学, 2023, 52(10): 109-119.
[6]	谭政委, 李磊, 余永亮, 许兰杰, 杨红旗, 董薇, 鲁丹丹, 马新明, 梁慧珍. 红花1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因CtDXS1的克隆及表达分析 [J]. 河南农业科学, 2021, 50(2): 39-49.
[7]	高耀辉, 魏光普, 马斌, 肖凤洁, 马明. 菊花CmSVP基因结构及表达模式分析[J]. 河南农业科学, 2021, 50(2): 124-129.
[8]	孟亚轩, 孙颖琦, 赵心月, 王凤霞, 瓮巧云, 刘颖慧. 主要禾本科作物ASR 基因家族全基因组鉴定及表达分析[J]. 河南农业科学, 2021, 50(12): 10-22.
[9]	孟婕, 王闯, 杨晴, 张贝, 李可强, 张传生, 耿立英, 李祥龙. 鸡GATA 基因家族鉴定及生物信息学分析[J]. 河南农业科学, 2021, 50(12): 163-169.
[10]	许兰杰, 梁慧珍, 余永亮, 杨青, 杨红旗, 谭政委, 董薇, 李磊, 安素妨, 鲁丹丹. 红花花器官形态与小孢子发育时期的关系研究[J]. 河南农业科学, 2021, 50(11): 55-61.
[11]	宫思宇, 于越, 郭冬雪, 杜亚琳, 郝宁, 武涛. 黄瓜蜡质合成相关基因CsCER4的克隆与表达分析[J]. 河南农业科学, 2020, 49(4): 101-106.
[12]	李任建, 申哲源, 李旭凯, 韩渊怀, 张宝俊. 谷子NBS-LRR类基因家族全基因组鉴定及表达分析[J]. 河南农业科学, 2020, 49(2): 34-43.
[13]	刘梦, 魏玉磊, 丁冬, 赵训超, 罗伟毅, 徐晶宇. 高粱LOX基因家族全基因组鉴定及表达模式分析[J]. 河南农业科学, 2020, 49(11): 37-44.
[14]	元志成, 柯余生, 吴富进, 王建平, 肖乃衍. 高粱COBRA基因家族全基因组的鉴定和表达分析[J]. 河南农业科学, 2020, 49(10): 33-41.
[15]	薛仁风, 丰明, 赵阳, 陈剑, 李韬, 葛维德. 普通菜豆生长素调节蛋白基因PvARP1的克隆及表达分析[J]. 河南农业科学, 2019, 48(9): 82-89.