猪伪狂犬病病毒gE 蛋白的真核表达及其活性鉴定

doi:10.15933/j.cnki.1004-3268.2023.03.014

河南农业科学 ›› 2023, Vol. 52 ›› Issue (3): 127-134.DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2023.03.014

猪伪狂犬病病毒gE 蛋白的真核表达及其活性鉴定

王清龙¹，王瑞宁^1,2，王勋^2,3，李青梅²，李鸽⁴，张真真³，杨苏珍²，郭军庆²，张改平^2,3,5

（1.河南牧业经济学院，河南郑州 450011；2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州 450002；3.河南农业大学动物医学院，河南郑州 450002；4.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；5.扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009）

收稿日期:2022-08-08 出版日期:2023-03-15 发布日期:2023-04-17
通讯作者: 张改平（1960-），男，河南内黄人，研究员，中国工程院院士，博士，主要从事动物免疫学研究。E-mail：zhanggaiping2003@163.com 郭军庆（1970-），男，河南林州人，教授，博士，主要从事动物免疫学研究。E-mail：13838248132@163.com
作者简介:王清龙（1978-），男，河南社旗人，副教授，主要从事生物化学研究。E-mail：zzmzwql@163.com
基金资助:
河南省重大科技专项（221100110600）；河南省农业科学院科技创新团队项目（2022TD02）

Eukaryotic Expression of Porcine Pseudorabies Virus gE Protein and Identification of Its Activity

WANG Qinglong¹，WANG Ruining^1,2，WANG Xun^2,3，LI Qingmei²，LI Ge⁴，ZHANG Zhenzhen³，YANG Suzhen²，GUO Junqing²，ZHANG Gaiping^2,3,5

（1.Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou 450011，China；2.Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；3.College of Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；4.College of Veterinary Medicine，Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling 712100，China；5.Jiangsu Co‑innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Received:2022-08-08 Published:2023-03-15 Online:2023-04-17

摘要/Abstract

摘要： 为制备猪伪狂犬病病毒（PRV）gE重组蛋白并评估其抗原活性，将优化的PRV gE 基因胞外区插入真核表达载体pCMV并在其C端加入Hexa-His标签，构建真核表达质粒pCMV-gE；将重组质粒转染HEK293F细胞，Dot blot鉴定转染细胞中gE重组蛋白的分泌表达；利用镍亲和层析和凝胶过滤层析从转染细胞培养上清中纯化gE表达蛋白；以SDS-PAGE和Western blot鉴定gE重组蛋白，利用PRV阳性血清以ELISA分析gE重组蛋白的抗原活性，通过去糖基化酶PNGase F鉴定其糖基化修饰及其对抗原活性的影响。Dot blot结果显示，gE重组蛋白通过自身信号肽实现在细胞培养上清的分泌表达，其表达量在转染96 h达到峰值。SDS-PAGE和Western blot结果显示，从细胞培养上清中纯化获得gE重组蛋白纯度约为90%，经去糖基化酶PNGase F处理的gE重组蛋白分子质量显著降低。间接ELISA结果显示，gE重组蛋白检测PRV阳性血清的抗体效价为1∶12 800；PRV阳性血清对gE蛋白的检出限为31.25 ng/mL，其抗原活性是原核表达的4倍。对临床血清的检测结果显示，基于gE重组蛋白的ELISA与IDEXX抗体检测试剂盒的符合率为96.5%。综上，在真核细胞中分泌表达了具有高表达量、高纯度、高活性和糖基化修饰的gE重组蛋白，在PRV感染鉴别检测中具有良好的应用潜力。

关键词: 猪伪狂犬病病毒, gE蛋白, 分泌表达, 糖基化修饰, 抗原活性

Abstract: In order to obtain the recombinant gE protein of porcine pseudorabies virus（PRV）and evaluate its antigenic activity，the optimized extracellular region of gE gene was inserted into the eukaryotic expression vector pCMV and the Hexa‑His tag was added to its C‑terminal to construct the eukaryotic expression plasmid pCMV‑gE.HEK293F cells were transfected with the recombinant plasmid，and secretory expression of the gE recombinant protein in the transfected cells was identified by Dot blot.The expressed gE protein was then purified from supernatant of the transfected cells by nickel affinity chromatography and gel chromatography，which was identified by SDS‑PAGE and Western blot.Furthermore，the antigenic activity of the gE recombinant protein was analyzed by ELISA using the PRV positive serum，and its glycosylation modification as well as its effect on the antigenic activity was analyzed by PNGase F treatment.Dot blot results showed that the gE recombinant protein was secreted and expressed in supernatant of the transfected cells through its own signal peptide，which reached its peak at 96 h post‑transfection.The results of SDS‑PAGE and Western blot showed that the purity of the gE recombinant protein purified from the cell supernatant was about 90%.Molecular weight of the gE recombinant protein after treated with disaccharidase PNGase F was significantly lower than that of the untreated protein.The indirect ELISA results showed that the gE recombinant protein detected PRV positive serum at 1∶12 800，while the detection limit of PRV positive serum for the expressed gE protein was determined as 31.25 ng/mL，whose antigen activity was four times that of the prokaryotically expressed protein.The detection of clinical serums showed that the coincidence rate between the gE‑based ELISA and IDEXX antibody detection kit was 96.5%.In conclusion，the recombinant gE protein with high expression level，high purity，high activity and glycosylation modification was secreted and expressed in eukaryotic cells，showing a good application potential in the differential detection of PRV infection.

Key words: Porcine pseudorabies virus, gE protein, Secretory expression, Glycosylation modification, Antigen activity

中图分类号:

S852.65

王清龙, 王瑞宁, 王勋, 李青梅, 李鸽, 张真真, 杨苏珍, 郭军庆, 张改平. 猪伪狂犬病病毒gE 蛋白的真核表达及其活性鉴定[J]. 河南农业科学, 2023, 52(3): 127-134.

WANG Qinglong, WANG Ruining, WANG Xun, LI Qingmei, LI Ge, ZHANG Zhenzhen, YANG Suzhen, GUO Junqing, ZHANG Gaiping, . Eukaryotic Expression of Porcine Pseudorabies Virus gE Protein and Identification of Its Activity[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2023, 52(3): 127-134.

参考文献

［1］TAN L，YAO J，YANG Y，et al.Current status and challenge of Pseudorabies virus infection in China［J］.Virologica Sinica，2021，36（4）：588‑607.
［2］MCCARTHY K M，TANK D W，ENQUIST L W.Pseudorabies virus infection alters neuronal activity and connectivity in vitro［J］.PLoS Pathogens，2009，5（10）：e1000640.
［3］VERPOEST S， CAY B， FAVOREEL H， et al.Age‑dependent differences in pseudorabies virus neuropathogenesis and associated cytokine expression［J］.Journal of Virology，2017，91（2）：e02058‑16.
［4］LIU Q，KUANG Y，LI Y，et al.The epidemiology and variation in pseudorabies virus：A continuing challenge to pigs and humans［J］.Viruses，2022，14（7）：1463.
［5］FAN S，YUAN H，LIU L，et al.Pseudorabies virus encephalitis in humans：A case series study［J］.Journal of Neurovirology，2020，26（4）：556‑564.
［6］TIRABASSI R S，TOWNLEY R A，ELDRIDGE M G，et al.Characterization of pseudorabies virus mutants expressing carboxy‑terminal truncations of gE：Evidence for envelope incorporation，virulence，and neurotropism domains［J］.Journal of Virology，1997，71（9）：6455‑6464.

［7］KATAYAMA S，OKADA N，YOSHIKI K I，et al.Protective effect of glycoprotein gC‑rich antigen against Pseudorabies virus［J］.Journal of Veterinary Medical Science，1997，59（8）：657‑663.

［8］GRANZOW H， WEILAND F， JÖNS A， et al.Ultrastructural analysis of the replication cycle of pseudorabies virus in cell culture：A reassessment［J］.Journal of Virology，1997，71（3）：2072‑2082.
［9］ZHENG H H，FU P F，CHEN H Y，et al.Pseudorabies virus：From pathogenesis to prevention strategies［J］.Viruses，2022，14（8）：1638.
［10］王寅彪.猪伪狂犬病野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断方法的建立及初步临床应用［D］.长春：吉林大学，2015.
WANG Y B.Development and initial application of an immunoassay for the discrimination between PRV‑infected and vaccinated animals［D］.Changchun：Jilin University，2015.
［11］王垚，金前跃，周稳，等.猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母表达及其单克隆抗体的筛选［J］.河南农业科学，2019，48（10）：133‑139.
WANG Y，JIN Q Y，ZHOU W，et al.Expression of Pseudorabies virus gE protein in Pichia pastoris and screening of its monoclonal antibodies［J］.Journal of Henan Agricultural Sciences，2019，48（10）：133‑139.
［12］郭忠欣，王天奇.猪伪狂犬病毒gE蛋白原核表达及野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用［J/OL］.中国动物传染病学报：1‑9［2023‑03‑20］.http://kns.cnki.net/kcms/detail/31.2031.S.20210307.1033.004.html.
GUO Z X，WANG T Q.Establishment and application of indirect ELISA for detection of antibody against PRV and prokaryotic expression of gE protein ［J/OL］.Chinese Journal of Animal Infectious Diseases：1‑9［2023‑03‑20］.http://kns.cnki.net/kcms/detail/31.2031.S.20210307.1033.004.html.
［13］凌蒙蒙，孙艺学，邓效禹，等.猪伪狂犬病病毒gE37~243蛋白的原核表达及gE蛋白抗体间接ELISA的建立［J］.中国兽医学报，2021，41（5）：853‑857.
LING M M，SUN Y X，DENG X Y，et al.Establishment of an indirect ELISA for detection antibodies against pseudorabies virus gE protein［J］.Chinese Journal of Veterinary Science，2021，41（5）：853‑857.
［14］朱和超，梁婉，范桂芳，等.利用杆状病毒表达系统表达PRV/gE蛋白及间接免疫荧光抗体（IDF）检测方法的建立［J］.中国兽医学报，2019，39（8）：1428‑1434.
ZHU H C，LIANG W，FAN G F，et al.Establishment of an indirect immunofluorescent antibody（IDF）detection method for PRV gE protein by using baculovirus expression system［J］.Chinese Journal of Veterinary Science，2019，39（8）：1428‑1434.
［15］METTENLEITER T C.Aujeszky’s disease and the development of the marker/DIVA vaccination concept［J］.Pathogens，2020，9（7）：563.
［16］郎巧利，吴梦，黄楠，等.伪狂犬病毒的gE蛋白胞外区真核表达以及单克隆抗体制备［J］.生物技术通报，2019，35（11）：96‑103.
LANG Q L，WU M，HUANG N，et al.Eukaryotic expression of extracellular domain of pseudorabies virus gE protein and preparation of monoclonal antibodies［J］.Biotechnology Bulletin，2019，35（11）：96‑103.
［17］周金龙，王同燕，颜世君，等.伪狂犬病病毒gE基因在昆虫细胞中的表达［J］.中国兽医科学，2016，46（2）：180‑184.
ZHOU J L，WANG T Y，YAN S J，et al.Expression of pseudorabies virus gE gene in insect cells［J］.Chinese Veterinary Science，2016，46（2）：180‑184.
［18］覃雅丽，陈焕春，唐勇，等.伪狂犬病病毒Ea株gE基因主要抗原区在巴斯德毕赤酵母中的表达［J］.微生物学报，2002（5）：543‑549.
TAN Y L，CHEN H C，TANG Y，et al.Expression of major antigenic domain of glycoprotein E of pseudorabies virus Ea strain in Pachia pastoris［J］.Acta Microbiologica Sinica，2002（05）：543‑549.
［19］华俊清.利用杆状病毒系统表达猪伪狂犬病毒gE蛋白和猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳N蛋白［D］.武汉：湖北大学，2012.
HUA J Q.Expression of gE protein of PRV and nucleocapsid N protein of PRRSV using baculovirus expression system［D］.Wuhan：Hubei University，2012.
［20］李鸽，刘肖，李青梅，等.猪流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备与鉴定［J］.河南农业科学，2019，48（08）：129‑133.
LI G，LIU X，LI Q M，et al.Preparation and identification of monoclonal antibodies against NP protein of swine influenza virus［J］.Journal of Henan Agricultural Sciences，2019，48（08）：129‑133.
［21］张洪亮，郝占武，解倩倩，等.伪狂犬病毒gB和gE蛋白重组表达及抗体间接ELISA检测方法的建立［J］.中国动物传染病学报，2022，30（1）：98‑105.
ZHANG H L，HAO Z W，XIE Q Q，et al.Expression of recombinant gB and gE proteins of Pseudorabies virus and development of indirect ELISA assay for antibody detection［J］.Chinese Journal of Animal Infectious Diseases，2022，30（1）：98‑105.
［22］任雪枫.猪伪狂犬病病毒gE抗原表位基因在巴斯德毕赤酵母中的表达和初步应用［D］.南京：南京农业大学，2004.
REN X F.Expression of Pseudorabies virus glycoprotein E epitopes in Picha pastoris and preliminary application［D］.Nanjing：Nanjing Agricultural University，2004.

[1]	鲍印, 翟洪月, 李慧敏, 袁志乔, 马玉静, 丁雨善, 阚云超, 姚伦广, 田志军, 冷超粮. 豫西南猪主要病毒性传染病流行病学调查[J]. 河南农业科学, 2021, 50(1): 152-157.
[2]	魏蔷, 白怡霖, 柴书军, 刘运超, 宋亚鹏, 张改平. 猪瘟病毒E^rns蛋白在杆状病毒表达系统中的分泌表达及活性检测[J]. 河南农业科学, 2020, 49(2): 136-141.
[3]	王垚, 金前跃, 周稳, 李旭锋, 柴永笑, 丁培阳, 陈晓, 邢云瑞, 李艳华, 郭军庆, 张改平. 猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母表达及其单克隆抗体的筛选[J]. 河南农业科学, 2019, 48(10): 133-139.
[4]	刘芳，张冲，王寅彪，赵朴，邓瑞广，李学伍. 猪伪狂犬病毒gD蛋白抗原表位的克隆及表达[J]. 河南农业科学, 2016, 45(4): 122-125.
[5]	张红;王健;李姣;易明林;韩鸿鹏;张改平;. 信号肽对鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白重组分子在COS7细胞上分泌表达的影响[J]. 河南农业科学, 2008, 37(2): 99-102.
[6]	杨金龙,潘康成,赵小林. 高产碱性蛋白酶地衣芽孢杆菌的研究进展[J]. 河南农业科学, 2005, 34(1): 59-61.

猪伪狂犬病病毒gE 蛋白的真核表达及其活性鉴定

Eukaryotic Expression of Porcine Pseudorabies Virus gE Protein and Identification of Its Activity

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