布鲁氏菌分泌蛋白BspA 和BspB 真核表达载体的构建及在胚胎滋养层细胞中的表达

doi:10.15933/j.cnki.1004-3268.2022.08.017

河南农业科学 ›› 2022, Vol. 51 ›› Issue (8): 143-149.DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2022.08.017

布鲁氏菌分泌蛋白BspA 和BspB 真核表达载体的构建及在胚胎滋养层细胞中的表达

王书利^1,2，魏淑娟³，李梦含²，郑好²，司丽芳¹，李志强²

（1.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003；2.商丘师范学院生物与食品学院，河南商丘 476000；3.河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007）

收稿日期:2022-01-08 出版日期:2022-08-15 发布日期:2022-09-23
通讯作者: 司丽芳（1976-），女，河南商丘人，副教授，博士，主要从事微生物与分子生物学研究。E-mail：136707026@qq.com 李志强（1986-），男，河北南宫人，讲师，博士，主要从事动物传染病致病机理及其免疫防治研究。 E-mail：lizhiqiangstr@126.com
作者简介:王书利（1988-），女，河北临漳人，实验师，硕士，主要从事动物病原分子生物学研究。E-mail：shuliwang1314@126.com
基金资助:
河南省高等学校重点科研项目（21A230015）；河南省重点研发与推广专项（科技攻关）（212102310746）

Construction of Eukaryotic Expression Vectors of Brucella Secretory Proteins BspA and BspB and Expression in Embryonic Trophoblast Cells

WANG Shuli^1,2，WEI Shujuan³，LI Menghan²，ZHENG Hao²，SI Lifang¹，LI Zhiqiang²

（1.College of Animal Science and Technology，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China；2.College of Biology and Food，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，China；3.College of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007，China）

Received:2022-01-08 Published:2022-08-15 Online:2022-09-23

摘要/Abstract

摘要： 为研究布鲁氏菌分泌蛋白BspA和BspB的作用，以布鲁氏菌S2308基因组为模板，根据GenBank登录的BspA和BspB基因序列设计引物，利用PCR扩增BspA和BspB基因片段，并将其克隆至pEGFP-N1载体，获得真核表达载体pEGFP-BspA和pEGFP-BspB。真核表达载体经酶切和测序分析鉴定后，利用Lipofectamine^TM2000脂质体转染至胚胎滋养层细胞（HPT-8），采用Western blot（WB）检测BspA和BspB蛋白的表达，应用ELISA试剂盒检测细胞因子的分泌水平，利用乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒检测细胞毒性水平。结果显示，BspA基因大小为576 bp，BspB 基因大小为564 bp，真核表达质粒经限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切验证正确，酶切产物经测序分析，显示与GenBank公布序列的同源性为100%；WB检测结果显示，pEGFP-BspA和pEGFP-BspB转染组分别在70 ku和68 ku处出现条带，与预期结果相符，表明BspA和BspB蛋白能在HPT-8细胞中表达；细胞因子检测结果显示，BspA和BspB蛋白可诱导HPT-8细胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5；细胞毒性检测结果显示，BspA和BspB蛋白对细胞无毒性。综上，成功构建了真核表达载体pEGFP-BspA和pEGFP-BspB，证实其能在HPT-8细胞中表达，并能诱导细胞因子分泌。

关键词: 布鲁氏菌, BspA蛋白, BspB蛋白, 真核表达, 胚胎滋养层细胞

Abstract: To study the role of Brucella secretory proteins BspA and BspB，two pairs of primers were designed according to BspA and BspB gene sequences of B.abortus S2308 from GenBank，and S2308 genome was used as template to amplify BspA and BspB genes by PCR.The fragments were cloned into pEGFP⁃N1 vector to obtain eukaryotic vectors pEGFP⁃BspA and pEGFP⁃BspB. After identification by enzyme digestion and sequencing analysis，LipofectamineTM 2000 was used to transfect the eukaryotic vectors into embryonic trophoblast cells（HPT⁃8）.BspAand BspB protein expressions were detected by Western blot（WB）.The secretion level of cytokines was detected by ELISA kit，and the level of cytotoxicity was detected by lactate dehydrogenase（LDH）cytotoxicity detection kit.The results showed that the full length of BspA gene was 576 bp and BspB gene was 564 bp. Eukaryotic vectors were verified by restriction enzyme EcoR Ⅰ and Xba Ⅰ digestion，and sequencing analysis showed that the homology was 100% between the sequencing information and sequence published by GenBank.WB detection results showed that the transfection groups of pEGFP⁃BspA and pEGFP⁃BspB dispalyed bands at 70 ku and 68 ku respectively，which was completely consistent with the expected results，indicating that BspA and BspB proteins could be expressed in HPT⁃8 cells.Cytokines test results showed that BspA and BspB proteins could induce HPT⁃8 cells to secrete IFN⁃γ，IL⁃2，IL⁃4 and IL⁃5.BspA and BspB proteins were non⁃toxic to HPT⁃8 cells.In summary，pEGFP⁃BspA and pEGFP⁃BspB eukaryotic expression vectors were successfully constructed，and BspA and BspB proteins could be expressed in HPT⁃8 cells and induce cytokines secretion.

Key words: Brucella, BspA protein, BspB protein, Eukaryotic expression, Embryonic trophoblast cell

中图分类号:

S831.4

王书利, 魏淑娟, 李梦含, 郑好, 司丽芳, 李志强. 布鲁氏菌分泌蛋白BspA 和BspB 真核表达载体的构建及在胚胎滋养层细胞中的表达[J]. 河南农业科学, 2022, 51(8): 143-149.

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布鲁氏菌分泌蛋白BspA 和BspB 真核表达载体的构建及在胚胎滋养层细胞中的表达

Construction of Eukaryotic Expression Vectors of Brucella Secretory Proteins BspA and BspB and Expression in Embryonic Trophoblast Cells

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