H5N1 亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

doi:10.15933/j.cnki.1004-3268.2024.03.013

河南农业科学 ›› 2024, Vol. 53 ›› Issue (3): 125-132.DOI: 10.15933/j.cnki.1004-3268.2024.03.013

H5N1 亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

屈小天¹，王雅楠²，许倩茹³，李雪洋³，张申立³，张二芹³，张改平^3,4

（1.河南农业大学生命科学学院，河南郑州 450046；2.吉林大学动物医学院，吉林长春 130062；3.河南农业大学动物医学院/国家动物免疫学国际联合研究中心，河南郑州 450046；4.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州 450002）

收稿日期:2023-05-05 出版日期:2024-03-15 发布日期:2024-04-19
通讯作者: 张改平（1960-），男，河南内黄人，教授，博士，主要从事动物免疫学研究。E-mail：zhanggaiping2003@163com
基金资助:
国家转基因生物新品种培育重大专项（2016ZX08001006-10）

Expression and Purification of H5N1 Subtype Avian Influenza Virus HA Protein in Rice Endosperm

QU Xiaotian¹，WANG Ya’nan²，XU Qianru³，LI Xueyang³，ZHANG Shenli³，ZHANG Erqin³，ZHANG Gaiping³

（1.College of Life Science，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450046，China；2.College of Veterinary Medicine，
Jilin University，Changchun 130062，China；3.College of Veterinary Medicine，Henan Agricultural University/International Joint Research Center of National Animal Immunology，Zhengzhou 450046，China；4.Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China）

Received:2023-05-05 Published:2024-03-15 Online:2024-04-19
About author:屈小天（1998-），男，河南光山人，在读硕士研究生，研究方向：免疫学。E-mail：qxt18103817315@163.com

摘要/Abstract

摘要： 为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性，利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA，该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子，有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中，筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗，采用CTAB法提取水稻叶片DNA，PCR鉴定结果显示，HA基因已插入到水稻基因组中，重组HA 基因大小为4 660 bp。将阳性植株移植到大田中，4个月后收获水稻种子，提取水稻胚乳蛋白，Western blot鉴定结果表明，HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化，其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗，免疫小鼠，小鼠血清具有较高的特异性抗体水平，表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上，成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统，并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。

关键词: H5N1亚型禽流感病毒, HA蛋白, 水稻胚乳表达, 蛋白质纯化

Abstract: In order to prepare the HA protein of H5N1 subtype avian influenza virus and evaluate its immunogenicity，the recombinant plant expression vector pCAMBIA1300‐HA was constructed to express the recombinant HA protein of H5N1 subtype avian influenza virus by using a rice expression system，which had a GT13‐specific promoter，signal peptide SP and terminator，and was conducive to the expression of exogenous genes in rice.The recombinant plasmid pCAMBIA1300‐HA was introduced into Agrobacterium tumefaciens EHA105 by electroconversion，and the positive colonies were screened to infect rice calli. After dark culture，hygromycin screening，differentiation，rooting，they grew into seedlings.The DNA of rice leaves was extracted by CTAB method，and the results of PCR identification showed that the HA gene had been inserted into the rice genome，and the size of the recombinant HA gene was 4 660 bp.The positive plants were transplanted into the field，and the rice seeds were harvested 4 months later，and then the rice endosperm protein was extracted.Western blot identification results showed that HA protein was successfully expressed in the rice endosperm.The recombinant HA protein was separated and purified by Q anion chromatography，hydrophobic chromatography and gel filtration chromatography，and its purity reached more than 90%.The purified recombinant HA protein was mixed with ISA 50V adjuvant and emulsified to make a vaccine，which was used to immunize mice.The mice serum had a high level of specific antibodies，indicating that the immunogenicity of the recombinant HA protein was better.In summary，a rice expression system for the recombinant HA protein of H5N1 subtype avian influenza virus was successfully constructed，and the recombinant HA protein with high purity and good immunogenicity was isolated and purified.

Key words: H5N1 subtype avian influenza virus, HA protein, Rice endosperm expression, Protein purification

中图分类号:

S855.3
Q786

屈小天, 王雅楠, 许倩茹, 李雪洋, 张申立, 张二芹, 张改平. H5N1 亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化[J]. 河南农业科学, 2024, 53(3): 125-132.

QU Xiaotian, WANG Ya’nan, XU Qianru, LI Xueyang, ZHANG Shenli, ZHANG Erqin, ZHANG Gaiping. Expression and Purification of H5N1 Subtype Avian Influenza Virus HA Protein in Rice Endosperm[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2024, 53(3): 125-132.

参考文献

［1］ABDELWHAB E M， ABDEL‐MONEIM A S.Epidemiology，ecology and gene pool of influenza A virus in Egypt：Will Egypt be the epicentre of the next influenza pandemic？［J］.Virulence，2015，6（1）：6‐18.

［2］DENG L，WANG B Z.A perspective on nanoparticle universal influenza vaccines［J］.ACS Infectious Diseases，2018，4（12）：1656‐1665.

［3］JAGGER B W，WISE H M，KASH J C，et al.An overlapping protein‐coding region in influenza A virus segment 3 modulates the host response［J］.Science，2012，337：199‐204.

［4］CHEN W S，CALVO P A，MALIDE D，et al.A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death［J］.Nature Medicine，2001，7：1306‐1312.

［5］NAEEM A，ELBAKKOURI K，ALFAIZ A，et al.Antigenic drift of hemagglutinin and neuraminidase in seasonal H1N1 influenza viruses from Saudi Arabia in 2014 to 2015［J］.Journal of Medical Virology，2020，92 （12）：3016‐3027.

［6］杨婷，王婧，李谦.基于血凝素的禽流感通用疫苗的研究进展［J］.药物生物技术，2016，23（2）：164‐168.

YANG T，WANG J，LI Q.Research progress on hemagglutinin‐based universal influenza A vaccines［J］.Pharmaceutical Biotechnology，2016，23（2）：164‐168.

［7］ABDELWHAB E M，SELIM A A，ARAFA A，et al.Circulation of avian influenza H5N1 in live bird markets in Egypt［J］.Avian Diseases，2010，54（2）：911‐914.

［8］冯书营，董仕桢，张树逍.H5N1亚型禽流感病毒疫苗的研究现状及应用前景［J］.中国畜牧兽医，2013，40（9）：208‐213.

FENG S Y，DONG S Z，ZHANG S X.Research status and application prospects of H5N1 subtype avian influenza virus vaccines［J］.China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，2013，40（9）：208‐213.

［9］SĄCZYŃSKA V，ROMANIK A，FLORYS K，et al.A novel hemagglutinin protein produced in bacteria protects chickens against H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses by inducing H5 subtype‐specific neutralizing antibodies［J］.PLoS One，2017，12（2）：e0172008.

［10］仝晓丹，王玉娟，杨仕标，等.禽流感病毒H5N1亚型HA蛋白在昆虫细胞中的表达、纯化及反应原性分析［J］.黑龙江畜牧兽医，2021（10）：72‐76.

TONG X D，WANG Y J，YANG S B，et al. Expression，purification and reactivity analysis of HA protein of Avian influenza virus H5N1 subtype in insect cells［J］.Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2021（10）：72‐76. ［11］WANG Z，YU Q，FU J，et al.Immune responses of chickens inoculated with recombinant Lactobacillus expressing the haemagglutinin of the avian influenza virus［J］.Journal of Applied Microbiology，2013，115 （6）：1269‐1277.

［12］范文辉，王萌，刘丽蓉，等.H5亚型流感病毒HA头部球状结构域在毕赤酵母中的高效表达及其免疫原性分析［J］.生物工程学报，2019，35（1）：49‐58.

FAN W H，WANG M，LIU L R，et al.High expression and immunogenicity analysis of HA globular head domain of H5 subtype avian influenza virus produced in Pichia pastoris［J］.Chinese Journal of Biotechnology，2019，35（1）：49‐58.

［13］LI C J，BU Z G，CHEN H L.Avian influenza vaccines against H5N1‘bird flu’［J］.Trends in Biotechnology，2014，32（3）：147‐156.

［14］赵翔玥，张二芹，许倩茹，等.禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白在水稻胚乳中的稳定、高效表达及活性鉴定［J］.华北农学报，2020，35（4）：230‐238.

ZHAO X Y，ZHANG E Q，XU Q R，et al.Stable and efficient expression of HA protein of avian influenza virus H9N2 subtype in rice endosperm and identification of activity［J］.Acta Agriculturae Boreali‐Sinica，2020，35（4）：230‐238. ［15］李雪洋.水稻表达H9N2 HA蛋白的纯化与单克隆抗体制备及免疫检测方法研究［D］.郑州：河南农业大学，2022.

LI X Y.Purification and monoclonal antibody peparation of H9N2 HA protein expressed in rice and immunoassay method establishment［D］.Zhengzhou：Henan Agricultural University，2022.

［16］丁一，魏际华，张宁，等.水稻胚乳细胞生物反应器研究进展［J］.中国稻米，2017，23（3）：6‐12.

DING Y，WEI J H，ZHANG N，et al.Progress on rice endosperm cells as a bioreactor［J］.China Rice，2017，23（3）：6‐12.

［17］WAHEED M T，ISMAIL H，GOTTSCHAMEL J，et al.Plastids：The green frontiers for vaccine production [J］.Frontiers in Plant Science，2015，6：1005.

［18］刘智民，任鹏飞，韩心语，等.H9N2亚型禽流感病毒感染鸡红细胞引起白细胞介素的免疫应答［J］.山西农业科学，2023，51（11）：1323‐1330.

LIU Z M，REN P F，HAN X Y，et al.Immune responses of interleukin induced by H9N2 subtype avian influenza virus infection in chicken erythrocytes［J］.Journal of Shanxi Agricultural Sciences，2023，51 （11）：1323‐1330.

［19］王勋，李鸽，李青梅，等.广谱性识别H7亚型禽流感病毒HA蛋白的单克隆抗体制备与鉴定［J］.河南农业科学，2022，51（11）：119‐126.

WANG X，LI G，LI Q M，et al.Preparation and identification of monoclonal antibody broadly recognizing HA protein of H7 subtype avian influenza virus［J］.Journal of Henan Agricultural Sciences，2022，51（11）：119‐126.

［20］李孟，李丹，谢芝勋，等.3株广西麻雀源H9N2亚型禽流感病毒对SPF鸡的致病性［J］.南方农业学报，2022，53（11）：3257‐3265.

LI M，LI D，XIE Z X，et al.Pathogenicity of three H9N2 avian influenza viruses of Guangxi sparrow origin to SPF chickens［J］.Journal of Southern Agriculture，2022，53（11）：3257‐3265.

［21］SĄCZYŃSKA V，ROMANIK‐CHRUŚCIELEWSKA A，FLORYS K，et al.Prime‐boost vaccination with a novel hemagglutinin protein produced in bacteria induces neutralizing antibody responses against H5‐subtype influenza viruses in commercial chickens［J］.Front Immunol，2019，10：2006.

［22］TANG X C，LU H R，ROSS T M. Hemagglutinin displayed baculovirus protects against highly pathogenic influenza［J］.Vaccine，2010，28（42）：6821‐6831.

［23］牛香香，李雪洋，许倩茹，等.水稻源禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白两种纯化方法的建立［J］.农业生物技术学报，2021，29（7）：1237‐1247.
NIU X X，LI X Y，XU Q R，et al.Establishment of two purification methods of avian influenza virus H9N2
Subtype HA protein from rice（Oryza sativa）［J］.Journal of Agricultural Biotechnology，2021，29（7）：1237‐1247.
［24］SCHIERMEYER A. Optimizing product quality in molecular farming［J］.Current Opinion in Biotechnology，2020，61：15‐20.
［25］PAUL M，RELJIC R，KLEIN K，et al.Characterization of a plant‐produced recombinant human secretory IgA with broad neutralizing activity against HIV［J］.mAbs，2014，6（6）：1585‐1597.
［26］MOON K B，PARK J S，PARK Y I，et al.Development of systems for the production of plant‐derived biopharmaceuticals［J］.Plants，2019，9（1）：30.
［27］申雪静，张二芹，许倩茹，等.狂犬病病毒G蛋白在水稻中的表达及遗传稳定性鉴定［J］.农业生物技术学报，2019，27（2）：204‐211.
SHEN X J，ZHANG E Q，XU Q R，et al.Expression of rabies virus G protein in rice（Oryza sativa） and identification of its genetic stability［J］.Journal of Agricultural Biotechnology，2019，27（2）：204‐211.
［28］ENTESARI M，WAKASA Y，ZANJANI B M，et al.Change in subcellular localization of overexpressed vaccine peptide in rice endosperm cell that is caused by suppression of endogenous seed storage proteins［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture（PCTOC），2018，133（2）：275‐287.
［29］陈浩，陈于红，朱德煦，等.重组蛋白质纯化技术［J］.中国生物工程杂志，2002，22（5）：87‐92.
CHEN H，CHEN Y H，ZHU D X，et al. The progress of recombinant protein purification techniques［J］.Progress in Biotechnology，2002，22（5）：87‐92.
［30］蒋世强，潘能庆，鄢航，等.重组蛋白纯化研究进展［J］.现代农业科技，2017（4）：250‐251.
JIANG S Q，PAN N Q，YAN H，et al.Research progress on purification of recombinant protein［J］.Modern Agricultural Science and Technology，2017（4）：250‐251.

[1]	陈甜梦, 蔡彤璇, 王嘉璐, 田牧野, 赵宝华, 刘东. 嗜水气单胞菌外膜蛋白TolB 的原核表达及生物信息学分析[J]. 河南农业科学, 2024, 53(2): 136-143.
[2]	孙雪珂, 丁培阳, 王思桥, 刘思源, 李明慧, 常泽杰, 陈艺兰, 李瑞琪, 张改平. 稳定表达猪δ 冠状病毒S1 蛋白CHO细胞系的构建与鉴定[J]. 河南农业科学, 2023, 52(6): 131-138.
[3]	李甜甜, 蒋大伟, 姬鹏超, 王银铃, 张改平. 传染性法氏囊病毒VP2蛋白的原核表达及其免疫效果评价[J]. 河南农业科学, 2020, 49(9): 136-142.
[4]	李旭锋, 王垚, 金前跃, 周稳, 柴永笑, 陈晓, 丁培阳, 张改平. 新城疫病毒HN蛋白的酵母表达及其活性鉴定[J]. 河南农业科学, 2020, 49(3): 145-150.
[5]	连凯琪, 周玲玲, 张明亮, 张慢, 王英杰, 林正丹, 宋玉伟. 塞尼卡谷病毒3ABC蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备[J]. 河南农业科学, 2020, 49(1): 123-127.
[6]	王冬雨，魏蔷，刘运超，刘畅，杨棋，崔颖磊，张改平. 猪瘟病毒E2蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析[J]. 河南农业科学, 2018, 47(3): 128-133,143.
[7]	连凯琪，周玲玲，张明亮，王英杰，张慢，宋玉伟. 新发猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达和纯化[J]. 河南农业科学, 2018, 47(11): 120-123.
[8]	鲍玲玲，李至敏，王小琴，汤亚兰，许文武，李志敏. 创伤弧菌FrsA蛋白的纯化及生化表征[J]. 河南农业科学, 2018, 47(11): 130-133.
[9]	朱丽丹，朱杰华，赵冬梅，杨志辉，徐进. 致病疫霉NLP家族基因PiNLP30的克隆、原核表达及蛋白质纯化[J]. 河南农业科学, 2014, 43(10): 74-78.

H5N1 亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

Expression and Purification of H5N1 Subtype Avian Influenza Virus HA Protein in Rice Endosperm

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